Analysis of microbial biofilms with innovative molecular methods

Neue molekularbiologische Methoden gewinnen bei der Untersuchung von Infektionskrankheiten zunehmend an Bedeutung. So stehen mit Nukleinsäureamplifikationstechniken (PCR) und der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) kulturunabhängige Verfahren zur Verfügung, die sich für die Diagnostik, Prävalenzstudien und für die Biofilmforschung eignen. Bei der FISH binden fluoreszenz-markierte Oligonukleotidsonden spezifisch an komplementäre RNA Sequenzen. Sie gewährt -durch Visualisierung- Einblicke in die Morphologie, die Stoffwechselaktivitäten und die räumliche Verteilung von Bakterien und deren Beziehung zum umliegenden Gewebe. Die beiden molekularbiologischen Verfahren (PCR und FISH) ergänzen damit die bisherigen konventionellen kulturellen Methoden und können somit unter anderem zu einer besseren Aufklärung der Ätiologie und der Pathogenese diverser Infektionskrankheiten beitragen. In der vorliegenden Arbeit wurden Sie benutzt, um die Rolle von putativen pathogenen Spezies bei chronischen Infektionen, der Parodontitis beim Menschen und der Dermatitis Digitalis beim Rind, zu untersuchen. An beide Infektionen sind komplexe mikrobielle Biofilme beteiligt, von welchen bisher nicht kultivierte Bakterienspezies einen erheblichen Teil ausmachen. Parodontitis ist eine akut oder chronisch verlaufende bakterielle Infektionskrankheit des Zahnhalteapparates. Welche ätiologische Rolle Selenomonas spp. dabei spielen, konnte bisher aufgrund widersprüchlicher Ergebnisse in diversen Prävalenzstudien nicht geklärt werden. Während sich in unserer Studie anhand der Dot Blot Analyse kein signifikanter Zusammenhang zwischen Selenomonas spp. und Parodontitis aufzeigen ließ, konnte die FISH einen wertvollen Hinweis über ihre Rolle bei der Biofilmarchitektur liefern. Im Gegensatz dazu konnte mittels der Dot Blot Analyse die vorherrschende Rolle von Filifactor alocis bei der Parodontitis eindeutig bestätigt werden. Der Erreger befindet sich somit auf Augenhöhe mit den bisher bekannten Oralpathogenen wie z.B. Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia und Fusobacterium nucleatum. Die FISH konnte hierbei durch Visualisierung des distinkten Aufbaus des Biofilms und Kolokalisationen mit anderen Erregern, seine Rolle als diagnostischer Markerkeim untermauern. In allen drei Arbeiten konnte durch die Kombination von PCR-basiertem Keimnachweis und FISH entscheidende Erkenntnisse zur Rolle der drei Bakterienspezies bei der Pathogenese dieser Biofilm-assoziierten Erkrankungen gewonnen werden. Bei der Dermatitis digitalis bei Rindern handelt es sich um eine ulcerative akut oder chronisch verlaufende Entzündung der Klauen v.a. bei Milchkühen, welche in Bezug auf beteiligte Mikroorganismen der Parodontitis sehr ähnelt. Guggenheimella bovis wurde dabei in einer schweizer Studie als möglicher pathogener Keim vermutet und nachgewiesen. Während die Dot Blot Analyse von deutschen Rindern keine Beteiligung von Guggenheimella bovis ergab, konnte mit Hilfe der FISH von zwei schweizer Bioptaten exemplarisch ihre Relevanz und die Interaktion mit dem Wirt an der Grenzfläche zum Gewebe gezeigt werden.Recently, innovative molecular biological methods for diagnosing infectious diseases have been gaining importance. Culture independent methods like polymerase chain reaction (PCR) and fluorescence in situ hybridization (FISH) provide promising opportunities for epidemiology and biofilm analysis. In FISH-experiments specific oligonucleotide probes targeting complementary RNA- sequences allow a culture independent identification of microorganisms in their natural environment. By visualization this method provides an insight into morphology, metabolism and spatial distribution of bacteria and their relation to circumjacent tissue. Both PCR and FISH add to conventional culture dependent methods and are able to improve understanding of aetiology and pathogenesis of different infectious diseases. In this work FISH and dot blot hybridization were used to examine the role of potential pathogens in chronic mixed infections as human periodontitis and dermatitis digitalis in cattle. Complex microbial biofilms are involved in both these infections including a majority of fastidious or yet uncultured species. Periodontitis is an inflammatory bacterial infection of the periodontium. As of yet various studies have been unable to reveal the aetiological relevance of Selenomonas spp. in periodontitis. In our dot blot examination we did not find any significant correlation between Selenomonas spp. and periodontitis. However, FISH showed high numbers and the spatial distribution and network of this microorganism. Therefore Selenomonas spp. are suspected to have an influence on biofilm formation and structure. In contrast dot blot experiments for F. alocis corroborate suspicion that this microorganism plays an important role in this infection,being highly prevalent in periodontitis samples as compared to healthy controls. Filifactor was on the same level with other widely accepted periodontal pathogens, for example Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia and Fusobacterium nucleatum. In this case, FISH confirmed F. alocis as an excellent marker organism for diagnostic assays, visualizing distinct structure of biofilm and co-localization phenomena. Dermatitis digitalis in cattle is an ulcerative acute or chronic inflammatory disease affecting the claws which is similar to periodontitis considering the mixed aerob-anaerob microflora. Guggenheimella bovis seemed to be a putative pathogen in a swiss study. While dot blot analysis in German cattle did not show any involvement of G. bovis, FISH could show in two Swiss biopsies their relevance and interaction with host being present deep in the tissue of infected sites. All three investigations, outlined above were able to give insights into the role of the three bacterial species in pathogenesis of biofilm associated diseases by combining PCR-based bacterial detection and FISH