molecular epidemiology and spatial distribution in biofilms

Parodontitis ist die bakteriell bedingte entzündliche Erkrankung aller Strukturen des Zahnhalteapparates und stellt im fortgeschrittenen Lebensalter die häufigste Ursache für Zahnverlust dar. Die Mikroflora parodontaler Läsionen ist der Zahnwurzel als komplexer, strukturell heterogener Biofilm aufgelagert und umfasst eine Vielzahl nicht oder nur schwer kultivierbarer Organismen, die erst durch die Einführung DNA-basierter Nachweisverfahren in den Blickpunkt der Forschung gerückt sind. Filifactor alocis ist ein solches schwer zu kultivierendes Bakterium, das in den vergangenen Jahren wiederholt bei Patienten mit chronischer Parodontitis (CP) und generalisierter aggressiver Parodontitis (GAP) nachgewiesen werden konnte. In der ersten Studie der vorliegenden Arbeit wurde eine für F. alocis spezifische Oligonukleotidsonde entwickelt und die Prävalenz des Organismus mit Dot Blot Hybridisierungen in insgesamt 490 subgingivalen Proben von GAP-Patienten, CP- Patienten und Parodontitis-resistenten (PR) Patienten untersucht. Darüber hinaus wurde mit Hilfe von Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) und anschließender Epifluoreszenzmikroskopie die räumliche Verteilung und strukturelle Anordnung von F. alocis in subgingivalen Biofilmen von GAP- Patienten analysiert. In der zweiten Studie dieser Arbeit wurde, mit denselben Methoden, die Prävalenz oraler Selenomonas spp., die in der Vergangenheit ebenfalls oft mit Parodontalerkrankungen assoziiert worden sind, in 742 Proben von GAP-, CP- und PR Patienten bestimmt und ebenso die räumliche Anordnung dieser Organismen in GAP-Biofilmen studiert. F. alocis erwies sich als hervorragender Markerkeim für parodontale Erkrankungen. Der Organismus konnte bei einem Großteil der CP- und GAP-Patienten detektiert werden und wies zugleich eine ausgesprochen niedrige Prävalenz in der PR Gruppe auf. Auch die mikroskopische Untersuchung subgingivaler Biofilme von GAP-Patienten ließ auf eine entscheidende Rolle von F. alocis bei der Pathogenese von Parodontalerkrankungen schließen. Der Organismus siedelte vornehmlich in der Tiefe der parodontalen Läsion in enger Nähe zur Wirtsabwehr und war, in Assoziation mit anderen Parodontalkeimen, an zahlreichen Formationen beteiligt, die eine strukturelle Organisation des Biofilms widerspiegelten. Die Prävalenz von Selenomonas spp. dagegen war nicht signifikant mit dem Vorliegen von Parodontalerkrankungen korreliert. FISH und die anschließende epifluoreszenzmikroskopische Analyse von GAP-Biofilmen zeigten jedoch, dass Selenomonas spp., wenn sie in einer Probe dargestellt werden konnten, oft in großer Zahl auftraten und in diesen Fällen einen wichtigen Beitrag zur Biofilmarchitektur leisteten. In der dritten Studie dieser Arbeit wurden Biopsien boviner Dermatitis digitalis (DD), einer entzündlich ulzerierenden Biofilmerkrankung der Rinderklaue, untersucht. Guggenheimella bovis, ein nur selten in DD-Läsionen nachzuweisendes Bakterium, konnte mit Hilfe von FISH tief im Gewebe, als Pionierkeim in einigem Abstand von der voranschreitenden bakteriellen Front, dargestellt werden. Die vorliegende Arbeit verdeutlicht eindrucksvoll den Wert einer kombiniert epidemiologischen und mikroskopischen Analyse der Beteiligung putativer Pathogene für das Studium von Biofilmerkrankungen.Periodontitis is an inflammatory disease of bacterial aetiology that affects all structures supporting and anchoring the tooth. In the adult population, periodontitis represents the most frequent cause of tooth loss. The microflora in periodontal lesions forms complex, structurally heterogeneous biofilms on the root surface of affected teeth and comprises a multitude of fastidious and as yet uncultured bacteria. Identification of these organisms was only made possible by the advent of culture-independent DNA-based techniques. Filifactor alocis is a fastidious, Gram-positive rod and was repeatedly detected in patients suffering from chronic periodontitis (CP) and generalized aggressive periodontitis (GAP) in recent years. For the first study of the present dissertation, a species-specific oligonucleotide probe was designed, and dot blot hybridizations were performed to determine the prevalence of F. alocis in a total of 490 subgingival samples from GAP patients, CP patients and periodontitis-resistant (PR) patients. Furthermore, fluorescence in situ hybridization (FISH) and subsequent epifluorescence microscopy were used to analyse the spatial distribution and structural arrangement of F. alocis in subgingival biofilms from GAP patients. In the second study, identical methods were employed to determine the prevalence of oral Selenomonas spp., regarded as candidate periodontal pathogens by some authors, in 742 samples from GAP, CP and PR patients. Moreover, the structural arrangement of these organisms in GAP biofilms was studied. F. alocis proved to be an excellent marker organism for periodontal disease. The species could be detected in the majority of CP and GAP patients and had an extremely low prevalence in the PR group. The microscopic analysis of subgingival biofilms from GAP patients suggested an important role of F. alocis in the pathogenesis of periodontal disease. The organism predominantly colonized the depth of periodontal pockets and contributed to numerous bacterial formations that reflect a structural organization of the biofilms. In contrast, the prevalence of Selenomonas spp. was not correlated with periodontal disease. However, FISH and subsequent microscopic analysis of GAP biofilms showed that, at least in some cases, Selenomonas spp. appeared in large numbers and made a relevant contribution to biofilm architecture. In the third study of the present work, biopsies from digital dermatitis (DD) lesions, an ulcerative inflammatory bovine foot disease, were analysed. With the help of FISH, Guggenheimella bovis, a Gram- positive coccoid rod that is only seldom detected in DD-lesions, could be visualized deep inside the tissue as a pioneer organism way ahead of the advancing bacterial front. The present work clearly demonstrates the advantages of a combined epidemiological and microscopic approach for the study of polymicrobial biofilm diseases