The effect of hypoxia and the hypoxia mimetic agent L-mimosine on the production of angiopoietin-like 4 in fibroblasts of the gingiva and the periodontal ligament

Einleitung: In der Zahnheilkunde stellt die Entwicklung von parodontalen Erkrankungen ein akutes Problem dar. Um unsere Kenntnisse über die Ätiologie und Therapie parodontaler Erkrankungen zu erweitern, ist ein umfassenderes Verständnis der Auswirkungen von Hypoxie auf das umliegende Gewebe unerlässlich. Hypoxie reguliert eine Vielzahl von Genen, die an der Pathogenese von Parodontitis beteiligt sind. Ein Beispiel ist Angiopoietin-like 4, welches eine wichtige Rolle in der Angiogenese und Knochenresorption spielt. Das Ziel dieser Studie war den Effekt von Hypoxie und dem Hypoxie-Mimetikum L-Mimosin auf die Angiopoietin-like 4 Produktion in Fibroblasten der Gingiva (GF) und des parodontalen Ligaments (PDLF) zu klären. Material und Methoden: Zur Umsetzung der Experimente wurden GF und PDLF in 2D- und 3D-Modellen in Zellkulturen mit Hypoxie oder dem Hypoxie-Mimetikum L-Mimosin behandelt. Zur Kontrolle dienten unbehandelte Zellen unter Normoxie. Um die HIF-1-Abhängigkeit der Angiopoietin-like 4 Produktion zu überprüfen, wurden die 2D-Zellkulturen mit Echinomycin, einem Inhibitor des HIF-1-Signalweges, behandelt. Jeweils die mRNA-Expression und die Protein-Produktion des Angiopoietin-like 4 wurden mittels qPCR respektive ELISA gemessen. Ergebnisse: Unsere Daten zeigen eine deutliche Steigerung von Angiopoietin-like 4 in hypoxischen Zuständen in Bezug auf die normoxische Kontroll-Gruppe. Sowohl die Stimulation mit L-Mimosine als auch die Hypoxie haben die Angiopoietin-like 4-Spiegel in den 2D-Modellen gehoben. Nach zusätzlicher Inkubation der Zellen in 2D-Modellen mit Echinomycin wurde die Produktion auf Protein- und mRNA-Ebene verringert. In den 3D-Modellen von GF und PDLF ist kein signifikanter Anstieg von Angiopoietin-like 4 zu beobachten. Schlussfolgerungen: Diese Resultate sprechen für eine HIF-1-abhängige Regulation von Angiopoietin-like 4, bei dessen Protein- und mRNA-Konzentrationen unter Hypoxie und L-Mimosin sich weitgehend eine Steigerung beobachten lässt. Zukünftige Studien werden zeigen, welche Rolle dieser Mechanismus im parodontalem Gewebe spielt.Background: The development of periodontal disease is an urgent problem of todays dentistry. To improve our knowledge on the etiology and treatment of periodontal disease extensive understandings of the impact of hypoxic conditions have on surrounding tissues is vital. Hypoxia regulates genes such as Angiopoietin-like 4, which plays a decisive role in angiogenesis and bone resorption. The objective of this thesis is to clarify the effect of hypoxia and the hypoxia mimetic agent L-mimosine (L-MIM) on the production of Angptl-4 on both mRNA and protein levels in human gingiva fibroblasts (GFs) and human periodontal ligament cells (PDLFs). Material and methods: For the experiments GF and PDLF were cultured in 2D- and 3D-models and exposed to hypoxia and the hypoxic-mimetic agent L-mimosine. The control group included fibroblasts under normoxic conditions. To verify the HIF-1 dependency of the Angptl-4 production 2D-cultures were treated separately with echinomycine an inhibitor of HIF-1 activity. The mRNA expression and protein production of Angptl4 were quantified by qPCR and ELISA, respectively. Results: Our data show an increase in angiopoietin-like 4 mRNA and protein levels in hypoxic conditions in comparison to the normoxic control group. Stimulation with both L-mimosine and hypoxia led to a rise in angiopoietin-like 4 levels in 2D monolayer cultures. The addition of echinomycin in the 2D cultures inhibited this increase in angiopoietin-like 4 mRNA and protein levels. In the 3D spheroid cultures of GF and PDLF the increase did not reach the level of significance at mRNA and protein level. Conclusion: Overall we found that hypoxia and the hypoxia mimetic agent L-mimosine can stimulate the angiopoietin-like 4 production in monolayer cultures of GF and PDLF. This increase depends on HIF-1 activity. In spheroid cultures the impact was not as distinct as in the monolayer cultures. Future studies will reveal how the modulation of angiopoietin-like 4 in the periodontium contributes to periodontal disease and regeneration.Medizinische Universität Wien, Diplomarbeit, 201