In vitro Studie zur Funktionalisierung von Bio-Gide Kollagenmembranen mit dem Sekretom oraler Zellen

Problemstellung und Zielsetzung: Ein therapeutischer Ansatz zur Förderung der durch Diabetes kompromittierten Knochenregeneration ist die Stimulierung der Angiogenese. Eine mögliche Strategie das zu erzielen, ist die Anwendung des Sekretoms von Hypoxie-konditionierten oralen Zellen. Ein geeignetes Protokoll zur Gewinnung des Sekretoms ist noch nicht etabliert. Das Ziel der Arbeit ist der Vergleich des Sekretoms von oralen Zellen, welche mit Hypoxie und Hypoxia Mimetic Agents (HMA) konditioniert wurden. Weiters ist derzeit noch unbekannt, ob Kollagenmembranen als Trägermaterialien für das Sekretom Hypoxie-konditionierter oraler Zellen geeignet sind. Material und Methoden: Oralen Fibroblasten von Gingiva, parodontalem Ligament und Pulpa (GF, PDLF, DPF) wurden unter dem Einfluss von Hypoxie und hypoxia mimetic agents (dimethyloxaloylglycine, deferoxamine, L-mimosine) 24h und 48h kultiviert und vascular endothelial growth factor (VEGF) im Sekretom mittels Immunassays gemessen. Weiters wurden die Kollagenmembranen mit dem Sekretom beladen. Anschließend wurde das von den Kollagenmembranen freigesetzte VEGF bestimmt, sowie der Einfluss der Überstände auf die Bildung von Osteoblasten und Osteoklasten gemessen. Ergebnisse: In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass orale Fibroblasten durch hypoxische und HMA-Konditionierung vermehrt VEGF freisetzen. Die AP-Färbung verdeutlichte, dass die Osteoblastogenese im Vergleich zur Kontrollgruppe sowohl durch Hypoxie als auch durch HMA nicht beeinflusst wurde. Die Daten der TRAP-Färbung zeigten, dass besonders die Überstände von Sek24h DFO und L-MIM - im Gegensatz zu Sek48h - die Osteoklastogenese deutlich inhibierten, was durch die in Sek24h enthaltenen HMA erklärt werden kann. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass Kollagenmembranen mit Überständen oraler Fibroblasten beladen werden können und dass VEGF von den Kollagenmembranen innerhalb von drei Stunden auch freigesetzt werden kann. Konklusion: Basierend auf unseren Untersuchungen konnte eine Stimulation der VEGF-Sekretion durch Hypoxie-Konditionierung oraler Fibroblasten erreicht werden. Sie zeigen auf, dass sich Kollagenmembranen mit Sekretom beladen lassen und dass VEGF freigesetzt wird. Weiterführende präklinische Studien werden nötig sein, um eine personalisierte Therapiemöglichkeit für kompromittierte Knochenheilung bei Diabetes zu entwickeln.Background and aim: One strategy to stimulate bone regeneration is to support angiogenesis. One possible strategy is the use of the secretome of hypoxia-conditioned oral cells but there is no qualified protocol for the extraction of the secretome established yet. Aim of this study is to compare the secretome of oral cells conditioned with hypoxia and hypoxia mimetic agents (HMA) based on the concentration of vascular endothelial growth factor (VEGF) and the effects on osteoblastogenesis and osteoclastogenesis in vitro. In addition, it is unknown, if collagen membranes can be used as carrier materials for the secretome of hypoxia-conditioned oral cells. Furthermore, the release of the secretome from collagen barrier membranes is assessed. Materials and Methods: Secretome from oral fibroblasts derived from oral tissue such as gingiva, periodontal ligament and dental pulp (GF, PDLF, DPF) were cultivated under hypoxia and HMA (dimethyloxalylglycin, deferoxamine, L-mimosine). After 24 hours the secretome was collected and the cells were cultivated for another 24 hours. Collagen membranes were lyophilized with the secretome and then incubated in medium to evaluate the release based on VEGF. We measured the release of VEGF in the supernatants from the collagen membranes and the secretomes via immunoassays. In addition the effects of the supernantants on osteoblastogenesis and osteoclastogenesis were evaluated. Results: We found that hypoxia and HMA stimulated the secretion of VEGF in oral fibroblasts. Osteoblastogenesis was not influenced by the secretome compared to the control. Sek24h which contained DFO or L-MIM inhibited osteoclastogenesis. In addition, we showed that collagen membranes can be used as carriers for the secretome and that VEGF was released within three hours. Conclusion: Based on the results of our experiments hypoxia conditioning is an appropriate strategy to stimulate the secretion of VEGF in oral fibroblasts. Collagen membranes can be used as carriers for the secretome and they can release VEGF. It requires further studies to develope a personalized therapy to overcome compromised bone healing in patients with diabetes.eingereicht von Markus MoroZusammenfassung in englischer SpracheMedizinische Universität Wien, Diplomarbeit, 201