Isolierung und Charakterisierung der ER-residenten Aminopeptidase ERMP1 und Untersuchung ihrer Funktion in der Prozessierung MHC I restringierter CTL Epitope

Die effiziente Generierung von Peptid-Epitopen aus zelleigenen oder viralen Proteinen für die Präsentation auf „Major Histocompatibility Complex I“ (MHC I) Molekülen ist essentiell für die Aktivierung des adaptiven Immunsystems und die Effektorfunktion der CD8+ zytotoxischen T-Zellen (CTLs). CTLs erkennen diese Peptide in Kontext mit MHC I Molekülen über ihren spezifischen T-Zellrezeptor (TCR). Die Generierung dieser Epitope ist das Resultat eines komplexen proteolytischen Prozesses, der im Zytosol und im endoplasmatischen Retikulum (ER) stattfindet. Im Zytosol generiert das Proteasom N-terminal verlängerte Epitop-Vorläufer. Diese werden durch weitere zytosolische Proteasen abgebaut, es sei denn, sie werden durch den „transporter associated with antigen processing“ (TAP) in das ER transportiert. Dort werden sie durch Aminopeptidasen getrimmt, um den Bindungsvoraussetzungen der MHC I Moleküle zu genügen. Im murinen System ist die „ER aminopeptidase associated with antigen processing“ (ERAAP) die bislang einzige beschriebene Aminopeptidase, die dieses N-terminale Trimming von CTL Epitopen vermitteln kann. Das Profil der proteolytischen Aktivität in angereichertem murinen ER kann jedoch nicht allein durch die Aktivität von ERAAP erklärt werden, was auf die Anwesenheit weiterer Aminopeptidasen mit einer potentiellen Funktion in der Antigenprozessierung hinweist. In dieser Arbeit konnte die immunologisch bislang noch nicht beschriebene Aminopeptidase ERMP1 (endoplasmic reticulum metallopeptidase 1) im murinen ER identifiziert werden. Nach Aufreinigung muriner Mikrosomen und anschließender Anionenaustausch-Chromatographie wurden die gesammelten Fraktionen mit fluorogenen Substraten auf Aminopeptidase-Aktivität getestet. Durch massenspektrometrische Analyse konnten in den beobachteten Peaks die schon beschriebenen Aminopeptidasen ERAAP, die „insulin regulated aminopeptidase“ IRAP und die immunologisch bislang nicht beschriebene Aminopeptidase ERMP1 identifiziert werden. Durch Fluoreszenzmikroskopie konnte die intrazelluläre Lokalisation von ERMP1 im ER durch Kolokalisation mit TAP verifiziert werden. Wie viele Komponenten des MHC I Prozessierungsweges wird auch die Expression von ERMP1 durch IFN-γ stimuliert. Dies macht ERMP1 zu einer potentiellen zweiten trimmenden Aminopeptidase im murinen ER. Überexpression von ERMP1 hat einen allelspezifischen Einfluss auf die globale MHC I Präsentation auf der Zelloberfläche und durch Überexpression und shRNA vermitteltes gene silencing konnte außerdem ein epitopspezifischer Effekt nachgewiesen werden. Da N-terminales Trimming durch ERAAP mit der Evasion von Tumoren und veränderter Immundominanz assoziiert wird, ist die detaillierte Charakterisierung der Aminopeptidase ERMP1 ein wichtiger Schritt zum Verständnis der MHC I Antigen-Prozessierung und der Generierung von CTL Epitopen im ER.Efficient generation of epitopes derived from intracellular or viral proteins for presentation on Major Histocompatibility Complex (MHC) class I molecules is essential for the activation of the adaptive immune system. Cytotoxic T-Lymphocytes (CTLs) recognize peptides in context with MHC class I molecules through their specific T-cell receptor (TCR). Recognition of MHC I/peptide complexes is required to fulfill CTL effector function i.e. to kill malignant or infected cells. Generation and presentation of peptide epitopes on MHC class I molecules is the result of a complex multi-step process, which takes place in two cellular compartments, namely the cytosol and the endoplasmic reticulum (ER). In the cytosol the proteasome generates N-terminally extended epitope precursors, which are transported by TAP into the ER and then trimmed by ER-resident aminopeptidases to match the requirements of the presenting MHC class I molecule. In the murine system, the “endoplasmic reticulum aminopeptidase associated with antigen processing” (ERAAP) is so far the only protease described to perform N-terminal trimming of CTL epitope precursors in the ER, as mice lack a homologue to the human enzyme ERAP2. However, the specificity profile of proteolytic activity found in enriched ER fractions cannot be fully explained by ERAAP alone, indicating the presence of additional aminopeptidases with potential roles in antigen processing. In this work, the identification of the “endoplasmic reticulum metallopeptidase 1” (ERMP1) and its contribution to antigen presentation on MHC class I molecules is described. After enrichment of murine ER and ion-exchange chromatography, fractions were screened for aminopeptidase activity with fluorogenic substrates. Analysis revealed three distinct peaks of proteolytic activity. Mass spectrometric analysis of the first two peaks identified the previously described aminopeptidases ERAAP and “insulin regulated aminopeptidase” (IRAP), while the third peak contained a novel aminopeptidase not yet implicated in antigen processing, ERMP1. Subcellular localization of the protein in the ER was confirmed by fluorescence microscopy through co-localization with TAP. Additionally, ERMP1 was found to be strongly inducible by IFN-γ, underlining a potential role in the MHC class I pathway. Overexpression and shRNA-mediated knockdown revealed an allele- and epitope specific effect on surface MHC I levels. As N-terminal trimming of ERAAP/ERAP1 is associated with tumour evasion and changing of epitope immunohierarchies, detailed characterisation of the newly identified peptidase would be an essential step towards the understanding of antigen processing in general and generation of CTL epitopes by N-terminal trimming in the ER