Pharmakologische und pharmakokinetische Untersuchungen zu Salicylalkoholderivaten aus Salicis cortex

In klinischen Studien sowie in verschiedenen Tiermodellen wurde die analgetische Wirksamkeit und die entzündungshemmende Wirkung von Weidenrindenextrakten gezeigt. Pharmakokinetische Studien belegten allerdings, dass für diese Wirkung nicht allein die aus den Salicylalkoholderivaten entstehende Salicylsäure verantwortlich gemacht werden kann. In dieser Arbeit sollten die Wirkungen der Salicylalkoholderivate in der Weidenrinde in Abgrenzung zur Salicylsäure genauer untersucht werden, um gegebenenfalls neue Wirkprinzipien der Droge zu entdecken. Eine bioaktivitätsgeleitete Fraktionierung eines 70% ethanolischen Weidenrindenextraktes mit dem ICAM-1 Assay als anti-inflammatorisches Zellmodell, führte zu der Isolierung der zwei Salicylalkoholderivate Salicortin und Tremulacin. Die Strukturaufklärung erfolgte mittels zweidimensionaler NMR-Experimente. Bei diesen beiden Salicinderivaten handelte es sich um Strukturen mit einer 1-Hydroxy-6-oxo-2-cyclohexencarbonsäureester-Partialstruktur. Sie zeigten im ICAM-1 Assay eine dosisabhängige Hemmung der TNF-α induzierten ICAM-1-Expression. Damit wirkten sie in vitro entzündungshemmend. Allerdings ließ sich durch Stabilitätsuntersuchungen unter Assay-Bedingungen nachweisen, dass diese Wirkung nicht auf die Substanzen selbst, sondern auf ihr Abbauprodukt Catechol zurückzuführen war. Sowohl Salicortin als auch Tremulacin wurden unter Assay-Bedingungen fast vollständig abgebaut. Catechol wurde als Abbauprodukt dieser Substanzen mit einer 1-Hydroxy-6-oxo-2-cyclohexencarbonsäureester-Partialstruktur, welche Grundvoraussetzung für die Bildung von Catechol ist, quantifiziert. Das Ausmaß der Aktivität im Assay und damit der entzündungshemmenden Wirkung korrelierte mit dem Abbau zu Catechol. Im Rahmen der bioaktivitätsgeleiteten Fraktionierung wurde außerdem eine schnelle und einfache Methode zur Quantifizierung der Flavonoide in dem untersuchten Weidenrindenextrakt und seinen Fraktionen per HPLC-DAD entwickelt. Die in vivo Relevanz des in vitro Abbaus von Salicylalkoholderivaten mit einer 1-Hydroxy-6-oxo-2-cyclohexencarbonsäureester-Partialstruktur zu Catechol wurde daraufhin mit Salicortin als Modellsubstanz überprüft. Nach oraler Gabe von 100 mg/kg KG Salicortin in Wistar-Ratten wurden sowohl Salicylsäure (tmax = 4,0 h; cmax = 10,9 µM; AUC0-8h = 54,4 µM∙h) als auch Catechol (tmax = 0,5 h; cmax = 13,0 µM; AUC0-8h = 35,4 µM∙h) als Metabolite von Salicortin in den enzymatisch aufgearbeiteten Seren der Tiere über einen Zeitraum von acht Stunden detektiert. Catechol wurde im Messbereich der HPLC-DAD nicht als freies Molekül gefunden. Es zeigte sich, dass Catechol nur in konjugierter Form als Phase-II-Metabolit im Serum der Tiere zu finden war. Hierbei lag es hauptsächlich als Sulfat und nur zu einem sehr geringen Teil als Glucuronid vor. Es wurde außerdem eine pharmakokinetischen Studie beim BfArM und der zuständigen Ethikkommission beantragt. Nach Genehmigung und zustimmender Bewertung der Institutionen, wurde in der Studie über 24 Stunden untersucht, ob Catechol nach Einnahme eines standardisierten Weidenrindenextraktes (entsprach 240 mg Gesamtsalicin) von gesunden Freiwilligen im Serum dieser Probanden zu finden war. Eine enzymatische Aufarbeitungs- und Quantifizierungsmethode für die HPLC-DAD von Catechol und Salicylsäure aus menschlichem Serum wurde entwickelt und validiert. Diese Methode wurde ebenfalls für die Auswertung der oben genannten Rattenseren übernommen, da die Selektivität und die Wiederfindung aus beiden Matrices sehr gut vergleichbar waren. Catechol (tmax = 1,2 h; cmax = 13,3 µM; t1/2 = 2,5 h; AUC0-∞ = 60,8 µM∙h) und Salicylsäure (tmax = 2,7 h; cmax = 24,5 µM; t1/2 = 2,4 h; AUC0-∞ = 127,8 µM∙h) wurden in den enzymatisch aufgearbeiteten Seren der Probanden quantifiziert. Auch hier wurde Catechol nur als Konjugat, hauptsächlich als Sulfat und nur in äußerst geringen Mengen als Glucuronid detektiert. Beide in vivo Studien zeigten erstmalig, dass Catechol sowohl im Tier als auch im Mensch ein Abbauprodukt und Metabolit von Salicylalkoholderivaten mit einer 1-Hydroxy-6-oxo-2-cyclohexencarbonsäureester-Partialstruktur ist. Für Catechol wurden in verschiedenen in vitro Modellen entzündungshemmende Eigenschaften beschrieben. Damit kann Catechol als ein neues Wirkprinzip der Weidenrinde angesehen werden. Der entzündungshemmende Einfluss von Catechol gegenüber Salicylsäure als Metabolit von Salicortin wurde in Ratten durch die perorale Gabe von Salicortin im Vergleich zu äquimolaren Mengen Salicin untersucht. Der Einfluss auf die Expression verschiedener proinflammatorischer Zytokine sowie Marker des oxidativen Stresses wurde in der Carrageen-induzierten Entzündung im „Six-day old air pouch Modell“ untersucht. Der zusätzliche Effekt von Catechol zur Salicylsäure war am deutlichsten bei der Hemmung der Myeloperoxidase-Aktivität im Exsudat, ein Marker des oxidativen Stresses. Außerdem wurde die Expression des Zytokins Interleukin 6 im Exsudat durch die Applikation von Salicortin stärker gehemmt als durch Salicin. Bei allen weiteren quantifizierten Entzündungsmediatoren konnte keine Überlegenheit von Catechol festgestellt werden. Salicin konnte stärker als Salicortin die Expression von TNF-α sowohl im Exsudat als auch im Plasma reduzieren. Ein Phase-II-Metabolit von Catechol, das Catecholglucuronid, wurde synthetisiert und in vitro im ICAM-1 Assay auf seine potentiell entzündungshemmenden Eigenschaften getestet. Er zeigte keine Aktivität. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass Catechol als Metabolit bestimmter Salicylalkoholderivate ein zusätzliches entzündungshemmendes Prinzip der Weidenrinde darstellt. Der Kern dieser Ergebnisfindung lag in der Stabilitätskontrolle des Salicortins unter ICAM-1-Assay-Bedingungen. Ohne diese Stabilitätsuntersuchung wäre Salicortin und nicht sein Abbauprodukt Catechol als die aktive Substanz im untersuchten Entzündungsmodell identifiziert worden. Sie führte zudem zu der Frage, ob dieser in vitro Befund auch in vivo eine Relevanz hat und lieferte letztendlich das Ergebnis, dass Catechol ein Metabolit der beschriebenen Sali-cinderivate in der Weidenrinde ist. Damit leistete die vorliegende Arbeit einen Beitrag zur Aufklärung des Wirkprinzips der Weidenrinde