Mechanisms of target regulation by the chimeric oncogene EWS-FLl1 in Ewing`s sarcoma

Ewing Sarkome sind hoch aggressive pediatrische Tumore, die sich durch eine chromosomale Translokation auszeichnen, welche in einem ETS Transkriptionsfaktor resultiert. Wir führten Genom weite Expressionsanalysen durch um transkriptionell regulierte Zielgene von EWS-FLI1 zu identifizieren. Um herauszufinden welche davon direkt reguliert werden, wurden Chromatin Immunoprezipitationen gefolgt von Sequenzierung (ChIP-seq) durchgeführt. Bioinformatische Analyen zeigten dass EWS-FLI1 an 50% der E2F Zielgene bindet. Darüber hinaus sind einige E2F Faktoren ebenfalls direkt durch EWS-FLI1 reguliert. Da E2F Faktoren den Zellzyklus regulieren, könnte die Regulierung von E2F Zielgenen durch EWS-FLI1 ein Weg sein, auf dem der Zellzyklus im Ewing Sarkom dereguliert wird. Auf Grund dessen untersuchten wir die funktionelle Interaktion zwischen EWS-FLI1 und E2F. Zehn zufällig ausgewählte Zielgene deren Promotoren von EWS-FLI1 und E2F gebunden waren, unter anderem E2F3, RAD51 und ATAD2, wurden in detaillierten Promoteranalysen durch Luziferase Reporter Assays in Kombination mit Mutationsanalysen für die EWS-FLI1 und E2F DNA Bindungsstellen studiert. Alle Promotoren der untersuchten Zielgene zeigten nach Knock-down von EWS-FLI1 verminderte Aktivität. Durch ChIPs konnten wir die direkte Bindung von EWS-FLI1 and die oben genannten Promotoren zeigen. Weiters konnten wir durch eine Analyse der Promoter Belegung demonstrieren, dass durch den Knock-down von EWS-FLI1 ein aktivierender E2F Faktor, E2F3, durch einen reprimierenden, E2F4, ausgetauscht wird. Interessant ist, dass dieser Austausch nur bei intakter ETS Bindungsstelle funktioniert, nicht aber wenn EWS-FLI1 nicht mehr an den Promoter binden kann. Die Mutation der ETS Bindungsstelle resultierte in reduzierter E2F3 Bindung. Unsere Daten stehen mit einem Modell in Einklang, in welchem EWS-FLI1 aktiv E2F3 zu Promotoren von gemeinsamen Zielgene rekrutiert und dadurch den reprimierenden Faktor E2F4 verdrängt. Dabei ist die Bindung von EWS-FLI1 essentiell für diesen Vorgang. Besonders hervorzuheben ist, dass dieser Mechanismus auch in einer TMPRSS2-ERG expremierenden Prostatakarzinom Zelllinie, nicht aber in einer nicht ETS-Fusion exprimierenden Zelllinie, gezeigt werden konnte.Ewing sarcoma is a highly aggressive pediatric cancer characterized by a chromosomal translocation leading to the chimeric ETS transcription factor EWS-FLI1 in 85% of cases. We have performed gene expression analysis to identify genes regulated at the transcriptional level by EWS-FLI1. To elucidate which of these are direct targets of EWS-FLI1 chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) was performed. Integrative bioinformatic analysis revealed that EWS-FLI1 directly binds to 50% of E2F target genes in Ewing Sarcoma. Furthermore, several E2F factors were also found to be directly regulated by EWS-FLI1. Since E2F family members regulate cell cycle progression, regulation of E2F target genes by EWS-FLI1 might be a major pathway of cell cycle deregulation in Ewing Sarcoma. Therefore, we studied the functional interaction of EWS-FLI1 with E2F. Ten arbitrarily chosen EWS-FLI1/E2F candidate targets including E2F3, RAD51, GEMIN4 and ATAD2 were chosen for an in-depth promoter activity analysis. We confirmed direct EWS-FLI1 promoter binding (ChIP-PCR) and observed decreased reporter activity for all ten studied promoters upon knockdown of EWS-FLI1 by RNAi. Furthermore, the study of promoter occupancy by different E2F family members revealed that silencing of EWS-FLI1 results in the exchange of activating E2F3 for repressive E2F4 on the promoters of their jointly regulated target genes. Importantly, testing E2F3 promoter occupancy on wildtype and ETS motif mutated promoter constructs in Ewing sarcoma cell lines revealed that binding of E2F3 to its target promoters is dependent on an intact ETS binding site. Mutation of the ETS motif resulted in decreased binding of E2F3. These data suggest a model in which EWS-FLI1 actively recruits an activating E2F factor thereby replacing a repressing E2F factor and in which EWS-FLI1 binding is essential for E2F binding. Strikingly, the functional E2F/ETS transcriptional module detected in Ewing Sarcoma for the chimeric ETS factor EWS-FLI1 was found in TMPRSS2-ERG expressing prostate cancer cells. Our findings therefore suggest that this mechanism might be also relevant to other ETS fusion driven cancers