Role of Clp-mediated proteolysis in the Gram-positive human pathogen Streptococcus pyogenes

Während einer Infektion sind pathogene Bakterien unterschiedlichen lebensfeindlichen Einflüssen wie saurem pH, erhöhter Temperatur, Nährstoffknappheit oder oxidativem Stress ausgesetzt, was zur Anhäufung von defekten, entfalteten oder denaturierten Proteinen führt, die für die Zellen toxisch sind. Die Familie der Clp Proteine ist für den Abbau von diesen aggregierten Proteinen und damit die Aufrechterhaltung des Protein Gleichgewichts verantwortlich. Frühere Studien haben gezeigt, dass Clp Proteine auch an der Virulenz von gram positiven Bakterien wie Staphylococcus areus, Listeria monocytogenes und Streptococcus pneumoniae beteiligt sind, wobei der dafür verantworliche Mechanismus bislang unbekannt ist. Unsere Untersuchungen beschäftigen sich besonders mit dem Einfluss der Clp vermittelten Proteolyse auf das human pathogene Bakterium Streptococcus pyogenes. Zu diesem Zweck wurden „in-frame“ Deletionsmutanten der Gene ClpP, kodierend für eine Protease sowie der Gene für die Clp ATPasen ClpC, ClpX und ClpE hergestellt und in unterschiedlichen phänotypischen Untersuchungen mit einem wildtyp Stamm verglichen. Wir konnten zeigen, dass diese ΔclpX und ΔclpP Mutanten phänotypische Veränderungen aufweisen hinsichtlich einer zeitlichen Wachstumsverzögerung, einer verstärkten Bildung von Biofilmen und Aggregaten, einer veränderten Kolonieform und Morphologie, einer reduzierten Transformierbarkeit als auch einer erhöhten Adhesion an Epithelzellen. Weiters führt das Fehlen von ClpX und ClpP zu einer höheren Toleranz gegenüber Temperaturveränderung und antibiotischen Substanzen wohingegen die Sensitivität in Bezug auf oxidativen oder osmotischen Stress zunimmt. Zudem konnten wir feststellen, dass ClpX, ClpP aber nicht ClpE die Expression von Exoproteinen beeinflussen, die zum Teil mittels Massenspektrometrie identifiziert wurden. Zusätzlich verstärken ClpX und ClpP die Expression der Zystein Protease SpeB, während die Expression des M Proteins, des Komplement-Inhibitors (Sic) sowie der Streptokinase (Ska) reduziert wird. Ausserdem beeinflussen ClpX und ClpP auch die Virulenz Regulatoren RopB, CovR, FasA und fasX RNA. Daher postulieren wir ein Model bei dem die ClpXP vermittelte Proteolyse von entscheidender Bedeutung für die transkriptionelle Regulierung von RopB, einem wichtigen Regulator für den Eintritt in die stationäre Phase, ist und dadurch die Physiologie, Adaption und Virulenz von S. pyogenes beeinflusst wird.During infection, pathogenic bacteria are exposed to hostile conditions such as acidic pH, increase of temperature, starvation or oxidative stress leading to an accumulation of aggregated, unfolded or denatured proteins, which are toxic for the cell. By degrading or refolding the damaged proteins, the Clp protein family allows the maintainance of protein homeostasis in bacterial cells. Moreover, previous studies showed that the Clp proteins are involved in the virulence of Gram-positive bacteria such as Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes and Streptococcus pneumoniae but the mechanisms by which this class of proteins regulates virulence factor expression remain unclear. Our study focused on the impact of the Clp-mediated proteolysis in the severe human pathogen Streptococcus pyogenes. To investigate Clp protein functions, in-frame deletion mutants of the protease encoding gene clpP and the Clp ATPase encoding genes clpC, clpE and clpX were generated and compared to the wild-type strain in a broad phenotypic analysis. We show that ΔclpX and ΔclpP mutants display aberrant phenotypes including a delay of growth, increased biofilm and aggregate formation, altered chain formation and cell morphology, deficiency in transformation and increased adhesion to epithelial cells. Additionally, a lack of clpX or clpP expression resulted in increased tolerance to heat and antibiotic stress while the sensitivity to oxidative and osmotic stress was elevated. At the molecular level, we demonstrate that ClpX and ClpP but not ClpE influence the expression of exoproteins, some of which were identified by mass spectrometry. Both ClpX and ClpP positively regulate the expression of cysteine protease SpeB whereas they negatively control the expression of M protein, the streptococcal inhibitor of complement (Sic) and streptokinase (Ska). Transcription of the virulence gene regulators, RopB, CovR, FasA and fasX RNA, was also affected in the ΔclpX and ΔclpP mutants. We propose a model where the ClpXP-mediated proteolysis is required for the transcriptional regulation of RopB, the main regulator for the entry into stationary phase, thereby altering the physiology, adaptation and virulence of S. pyogenes