Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry in Studies of Steroid Hormones and Steroid Glucuronide Conjugates in Brain and Urine

Steroids are endogenous compounds, which are present in the body tissues and fluids in free and conjugated forms, e.g. as steroid glucuronide conjugates. First goal of the study was to develop methodologies for the synthesis of steroid glucuronides. An enzyme-assisted synthesis was carried out to produce glucuronide-conjugated steroids at milligram levels. Hepatic microsomal preparations of bovine, porcine, and Arochlor-induced rats were compared with respect to specificity and efficiency of uridine diphosphate glucuronosyl transferase (UGT) enzymes in steroid glucuronidation. Both bovine and porcine liver microsomes efficiently produced the steroid glucuronides of all eight steroids studied, whereas rat liver microsomes produced glucuronides efficiently only for three steroids. Synthesized steroid glucuronides were purified with solid-phase extraction (SPE) or LC fractionation and characterized by nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR), liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) and high resolution MS. Steroid glucuronides were obtained in milligram amounts with good yields. The synthesised glucuronides were used in method development and as reference material in the analysis. As a second goal of the study, two methods were developed, one for brain samples using capillary liquid chromatography-electrospray-tandem mass spectrometry (CapLC-ESI-MS/MS) and the other for the urine samples using ultra performance liquid chromatography-electrospray-tandem mass spectrometry (UPLC-ESI-MS/MS).The methods were carefully optimized to obtain good selectivity and maximum sensitivity. Linear range of 3-4 magnitudes was obtained (R2> 0.996) with good precision (RSD < 15%). Detection limits of 6-100 pmol/l were obtained for steroid glucuronides, 10-30 pmol/l for steroid sulphates and 0.03-22 nmol/l for free steroids, respectively. The developed methods were applied to the analysis of mouse brain extracts, to study in vitro metabolism of steroids in rat and mouse brain, and to the analysis of free and glucuronide conjugated steroids during pregnancy. Using the CapLC-MS/MS method steroid glucuronides were observed for the first time in brain. The UPLC-MS/MS method employed in determination of urinary profiles of steroids and steroid glucuronide conjugates steroids during pregnancy. The concentrations of 36 targeted steroids and steroid glucuronides as well as the mostly unidentified C21-steroid glucuronides clearly altered during the pregnancy. In general, the concentrations of the steroids and steroid glucuronides gradually increased during pregnancy, decreased rapidly just before or during delivery, and returned to control sample level five days after the delivery.Steroidi hormonit ovat elimistön omia yhdisteitä, jotka esiintyvät elimistön kudoksissa ja nesteissä vapaassa muodossa, sitoutuneena proteiineihin sekä konjugoituina esim. steroidi glukuroni konjugaatteina. Tutkimuksen ensimmäinen tavoite oli kehittää entsyymiavusteisia synteesimenetelmiä steroidi glukuronien tuottamiseksi vertailuaineeksi menetelmän kehitykseen. Uridiini difosfaatti glucurononyylitransferaasi (UGT) entsyymien spesifisyyttä ja tehoa vertailtiin naudan, sian ja rotan maksan mikrosomi-preparaatteissa. Naudan ja sian maksa tuottivat tehokkaasti synteesituotteet kaikille kahdeksalle tutkitulle steroidille, kun taas rotan maksa tuotti tehokkaasti synteesituotteet vain kolmelle tuotteelle. Synteesituotteet puhdistettiin ja karakterisoitiin. Puhdistettuja steroidi glukuroneja pystyttiin tuottamaan milligramma määriä hyvällä puhtausasteella (>85 %). Tuotettuja steroidi glukuroneja käytettiin menetelmän kehityksessä ja menetelmien vertailuaineina. Tutkimuksen toinen tavoite oli menetelmän kehitys steroideille ja steroidi glukuroni konjugaateille biologisista matriiseista. Yksi menetelmä kehitettiin aivonäyteille käyttäen kapillaari nestekromatografia-tandem massaspektrometriaa (CapLC-MS/MS) ja toinen virtsanäytteille käyttäen korkean suorituskyvyn kromatografia -tandem massaspektrometriaa (UPLC-MS/MS) hyödyntäen. Menetelmät optimointiin ja validointiin. Menetelmät havaittiin soveltuviksi käyttötarkoituksiinsa. Menetelmien havaintorajat olivat 6-100 pmol/l steroid glukuronideille, 10-30 pmol/l steroidi sulfaateille ja 0.03-22 nmol/l vapaille steroideille. Kehitettyjä menetelmiä sovellettiin hiiren aivojen analyyseissä, in vitro metabolian tutkimiseen rotan ja hiiren aivoista valmistetuista S9 preparaateissa ja raskauden aikaisten virtsanäytteiden tutkimiseen. CapLC-MS/MS menetelmää hyödyntäen voitiin osoittaa ensimmäistä kertaa maailmassa steroidi glukuronien esiintyminen aivoissa. UPLC-MS/MS menetelmää hyödyntäen seurattiin steroidi ja steroidi glukuroni profiilien muuttumista raskauden aikana. Kolmenkymmenenkuuden tunnetun ja tuntemattoman steroidin ja steroidiglukuronin pitoisuus muuttui selvästä raskauden edetessä. Yleisesti, pitoisuudet nousivat asteittain heti raskauden alkamisen jälkeen ja pienenivät juuri ennen synnytystä tai synnytyksen aikana, ja palasivat kontrollinäytteen tasolle viisi päivää synnytyksen jälkeen