Method development for the analysis of steroids, vitamin D and oxysterols

Steroids, vitamin D and oxysterols are all part of a group of compounds called lipids, which are generally important in the function of the human body and in many cases the monitoring of these analytes can be of high value. Therefore, the development of a sensitive and universal method, suitable for the simultaneous analysis of these compounds, is of a great importance. In this study, the goal was to develop and test new mass spectrometry based methods for analyzing steroids, vitamin D and oxysterols. First, the feasibility of capillary liquid chromatography-microchip atmospheric pressure photoionization-tandem mass spectrometry was examined for the analysis of anabolic steroids in human urine. The results show that this microchip based method can be feasible for analyzing non-polar and neutral compounds in biological samples. Next, a microfluidic-based liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometric system (HPLC-Chip/ESI/MS) was compared to a conventional liquid chromatography-electrospray/mass spectrometric system (LC-ESI/MS) for the analysis of steroids. The sensitivity of the HPLC-Chip/MS system was ~50 times higher compared to the conventional LC-MS when injected amounts are compared. The feasibility of the HPLC-Chip/MS system in the analyses of non-derivatized steroids was also tested and the developed method was used in the analysis of mouse plasma samples. An ion mobility mass spectrometry method using a compact traveling wave cell (TWIM-MS) was also developed for the separation of steroid isomers. Three steroid isomer pairs were analyzed in their native form and as their p-toluenesulfonyl isocyanate derivatives. The results show, that the developed TWIM-MS method provides a reliable, fast and repeatable method for separating derivatized steroid isomers. Finally, an ultra-high-performance liquid chromatography-atmospheric pressure photoionization-tandem mass spectrometric (UHPLC-APPI-MS/MS) method was developed for the simultaneous analysis of oxysterols and vitamin D related compounds in mouse brain and cell line samples. An UHPLC-APPI-high resolution mass spectrometric method was developed for confirmatory analysis and for the identification of non-targeted oxysterols. Several oxysterols were quantified in the mouse brain and cell line samples. Additionally, 25-hydroxyvitamin D3 was detected in mouse brain samples for the first time. In conclusion, the methods developed in this work are sensitive and selective new methods for the analysis of the selected lipids from biological samples. The methods provide new insights in the analysis of steroids, vitamin D related compounds and oxysterols, and with some additional development some of the presented methods could be implemented e.g. in routine laboratories.Steroidit, d-vitamiini sekä kolesterolin hapetustuotteet ovat kaikki osa yhdisteryhmää nimeltään lipidit. Lipidit ovat hyvin tärkeitä ihmiskehon toiminnassa ja monesti näiden yhdisteiden pitoisuuksien seuraaminen voi olla tärkeää esim. sairauksien diagnostiikassa. Tästä syystä herkkien ja selektiivisten menetelmien kehitys on tärkeää näiden yhdisteiden analytiikassa. Työn tarkoituksena oli kehittää ja testata uusia massa spektrometriaan pohjautuvia menetelmiä valittujen lipidien analytiikassa. Ensin kehitettiin mikroilmanpainefotoionisaatio-kapillaari nestekromatografia-tandem massaspektrometriaa hyödyntävä analyysimenetelmä anabolisten steroidien määritykseen virtsanäytteistä. Tulokset osoittavat, että tämä uutta tekniikkaa hyödyntävä menetelmä saattaa soveltua poolittomien ja neutraalien yhdisteiden analysointiin biologisista näytteistä. Seuraavaksi kehitettiin mikrofluidistiikkaan pohjautuva nestekromatografia-sähkösumutus-massaspektrometria menetelmä, jota verrattiin perinteiseen nestekromatografia-massaspektrometriseen menetelmään steroidien määrityksessä. Vertailun johtopäätös on, että mikrofluidistiikkaan pohjautuva menetelmä on parhaimmillaan n. 50 kertaa herkempi perinteiseen menetelmään verrattuna. Mikrofluidistiikkaan pohjautuvaa tekniikkaa kokeiltiin hiirten plasmanäytteiden analysointiin. Ioniliikkuvuutta hyödynnettiin tämän tutkimuksen puitteissa steroidien isomeerien erottamiseen toisistaan. Tähän tarkoitukseen steroideista tehtiin johdos ja tulokset osoittavat luotettavan, nopean ja toistettavan menetelmän steroidien isomeerien erotukseen. Tutkimuksen viimeisessä osassa kehitettiin kaksi korkean suorituskyvyn nestekromatografia-massaspektrometrista menetelmää kolesterolin hapetustuotteiden sekä d-vitamiinin analysointiin solulinja- ja hiirten aivonäytteistä. Ensimmäinen menetelmä oli tandem massaspektrometriaan pohjautuva menetelmä, jota käytettiin pitoisuusmäärityksiin. Toinen menetelmä puolestaan oli lentoaikamassaspektrometriaa hyödyntävä menetelmä, jota käytettiin tulosten vahvistukseen sekä tuntemattomien hapetustuotteiden tunnistukseen. Kehitettyjen menetelmien avulla kyettiin määrittämään monen kolesterolin hapetustuotteen pitoisuudet näytteissä. Lisäksi havaittiin yksi d-vitamiinin metaboliatuotteista hiirten aivonäytteistä. Tässä työssä kehitetyt menetelmät ovat herkkiä ja selektiivisiä uusia menetelmiä valittujen lipidien analysointiin biologisista näytteistä. Kehitetyt menetelmät tuovat uusia näkökulmia steroidien, d-vitamiinin ja kolesterolin hapetustuotteiden analysointiin ja pienellä jatkokehityksellä näitä menetelmiä voisi myös hyödyntää rutiinilaboratorioissa