Molecular mechanisms of the antiproliferative activity of ruthenium(II)-arene complex with isoquinoline-3-carboxylic acid as ligand under in vitro conditions

Još od otkrića cisplatine sintetisan je veliki broj kompleksa prelaznih metala, čija je antikancerska aktivnost ispitana. Naročitu pažnju zaslužuju jedinjenja zasnovana na rutenijumu kao metalu koja su pokazala antitumorsku i antimetastatsku aktivnost, sa potencijalnom primenom kod tumora rezistentnih na cisplatinu, ili kao alternative cisplatini. Cilj ove disertacije je ispitivanje molekularnih mehanizama antiproliferativne aktivnosti rutenijum(II)-arenskog kompleksa sa izohinolin-3-karboksilnom kiselinom kao ligandom. Rezultati ispitivanja citotoksičnog potencijala sedam novih jedinjenja opšte formule [Ru(η6-p-cimen)(L1-7)Cl] su pokazali da je kompleks sa L = izohinolin-3-karboksilnom kiselinom (RuT7) u odnosu na ostale komplekse iz serije, ispoljio izraženu citotoksičnu aktivnost, sa IC50 vrednostima u opsegu od 18,5 do 84,2 μM. Ovaj kompleks je pokazao dva puta veću aktivnost na HeLa ćelijama nego na normalnoj ćelijskoj liniji MRC-5, što potvrđuju i IC50 vrednosti određene nakon inkubacionog perioda od 48 h (45,4 ± 3,0 i 84,2 ± 5,7 μM). Analiza ćelijskog ciklusa HeLa ćelija koje su tretirane RuT7 kompleksom pokazala je zaustavljanje ćelija u S fazi ćelijskog ciklusa, kao i povećanje broja ćelija u sub-G1 populaciji. Aneksin V-FITC/PI esej, kao i morfološka analiza ćelija na fluorescentnom mikroskopu, pokazali su da ispitivano jedinjenje ima potencijal indukcije apoptoze. Ispitivanje akumulacije rutenijuma unutar ćelija je pokazalo prisustvo rutenijuma u ćelijskoj unutrašnjosti nakon 6 h inkubacije (8,9 ng Ru/106 ćelija). U cilju detaljnog ispitivanja mehanizma dejstva RuT7 kompleksa na HeLa ćelijama, urađena je mikroerej analiza promena u genskoj ekspresiji na celom transkriptomu HeLa ćelija. Analiza funkcionalnih kategorija i signalnih i biohemijskih puteva koji se menjaju tokom odgovora HeLa ćelija na tretman RuT7 kompleksom je pokazala da se pod uticajem tretmana aktiviraju molekularni mehanizmi koji vode ćelije u apoptozu i to preko unutrašnjeg (mitohondrijskog) signalnog puta. Do aktiviranja mitohondrijskog apoptotskog puta dolazi usled direktnog vezivanja RuT7 kompleksa za DNK molekul, kao i indirektnim oštećenjem DNK usled dejstva reaktivnih kiseoničnih vrsta. Statistička analiza promena u ekspresiji genskih setova uključenih u poznate puteve toksičnosti koje su izazvane lekovima je pokazala manju predviđenu toksičnost RuT7 kompleksa u poređenju sa cisplatinom. Sveobuhvatno, dobijeni rezultati predstavljaju osnovu za dalja istraživanja RuT7 kompleksa u okviru studija na životinjama i prekliničkim ispitivanjima kao potencijalnog kandidata za hemioterapeutika.Since the discovery of cisplatinum, many transition metal complexes have been synthesized and assayed for antineoplastic activity. In recent years, ruthenium-based compounds have emerged as promising antitumor and antimetastatic agents with potential uses in platinum-resistant tumors or as alternatives to platinum. The aim of this thesis was to investigate molecular mechanisms of the antiproliferative activity of ruthenium(II)-arene complex with isoquinoline-3-carboxylic acid as ligand. The results of investigation of the cytotoxic potential of seven new compounds of the general formula [Ru(η6-p-cymene)(L1-7)Cl] showed that the complex with L = isoquinoline-3-carboxylic acid (RuT7) was two times as active on HeLa cells compared to normal cell line MRC-5, as indicated by IC50 values determined after 48 h of incubation (45,4 ± 3,0 vs. 84,2 ± 5,7 μM, respectively). Cell cycle analysis of HeLa cells treated with RuT7 showed S phase arrest and an increase in sub-G1 population. The apoptotic potential of the title compound was confirmed with the Annexin V-FITC/PI assay together with a morphological evaluation of cells using fluorescent microscopy. Analysis of the intracellular accumulation of ruthenium showed 8,9 ng Ru/106 cells after 6 h of incubation. To gain further insight in the molecular mechanism of action of RuT7 on HeLa cells, a whole-transcriptome microarray gene expression analysis was performed. Analysis of functional categories and signaling and biochemical pathways associated with the response of HeLa cells to treatment with RuT7 showed that it leads the cells through the intrinsic (mitochondrial) apoptotic pathway, via indirect DNA damage due to the action of reactive oxygen species, and through direct DNA binding of RuT7. Statistical analysis for enrichment of gene sets associated with known drug-induced toxicities identified fewer associated toxicity profiles in RuT7-treated cells compared to cisplatin treatment. Altogether these results provide the basis for further development of RuT7 in animal and pre-clinical studies as a potential drug candidate