Study of the reproductive biology and chemical communication of sea cucumbers (Holothuria arguinensis and H. mammata)

New sea cucumber fisheries are emerging in the Mediterranean Sea and Atlantic Ocean in response to a strong Chinese market demand. However, little is known about the biology of the new target species, hindering decisions on their management. The main objective of the present thesis was to study the reproductive biology and the role played by chemical communication and chemosensory systems in Holothuria arguinensis and Holothuria mammata. The different populations sampled in a narrow range along the Iberian Peninsula varied in size/weight, gonadal production, and maturity profile within each species, suggesting the influence of singular features of each location. However, they had all the same general reproductive pattern with a summer-autumn spawning. These results, essential to manage populations, were also useful to determine when to develop bioassays to test whether and how these species communicate during reproduction. Male sea cucumbers, but not females, release chemicals that attract and induce spawning in both sexes. A preliminary analysis of the male spawning water suggests a pheromone with multiple components, among them possibly phosphatidylcholine derivatives. Histology, histochemistry and immunohistochemistry of the potential chemosensory structures involved in the detection of these cues – tentacles, papillae and tube feet – show no obvious differences between them. However, the disc was the most specialized area, with a specific nerve arrangement, rich in nitric oxide synthase and containing numerous cells some of which are likely sensory neurons. The analysis of tissue transcriptomes revealed the presence of at least 591 G-protein-coupled receptors among them at least seven putative odorant receptors distributed mainly in the tentacles, oral cavity, calcareous ring and, papillae and tegument. Overall, this thesis gives valuable insights for sea cucumber fisheries management in the region and a better understanding of how sea cucumbers communicate during reproduction.Estão a emergir novas pescarias de pepinos do mar no mar Mediterrâneo e Oceano Atlântico em resposta à forte procura do mercado chinês. Contudo, sabe-se pouco sobre a biologia e história de vida destas novas espécies alvo, o que prejudica as decisões sobre a sua gestão. O principal objectivo desta tese é o estudo da biologia reprodutiva e o papel da comunicação química e sistema quimiosensorial em Holothuria arguinensis e Holothuria mammata. Sabe-se que a comunicação química está envolvida nos processos reproductivos em vários invertebrados marinhos. No entanto, tem sido pouco investigada nos equinodermes e sabe-se pouco acerca da natureza química dos compostos e dos mecanismos sensoriais envolvidos, assim como dos efeitos que desencadeia. Esta tese tem como objectivos específicos: i) adquirir conhecimentos sobre as características reprodutivas das espécies de interesse, ii) determiner se e como os pepinos do mar comunicam durante a reprodução e procurar identificar os compostos envolvidos, iii) caracterizar as estruturas em contacto directo com o ambiente que potencialmente estão envolvidas na detecção de sinais químicos, e iv) caracterizar o reportório de quimioreceptores e identificar possíveis receptores de odorantes nos tecidos analisados. As populações de H. arguinensis e H. mammata amostradas numa estreita faixa territorial da Peninsula Ibérica variaram tamanho, perfil de produção e maturação das gónadas, o que sugere a influência de características únicas de cada local. Havia maiores indivíduos de H. arguinensis e com gónadas mais pesadas em Sagres e na Ria Formosa comparado com Olhos de Água onde se encontraram mais indivíduos imaturos. A gametogénese e a postura era mais longa em Sagres o que pode ser devido a condições nutricionais e de maré (subtidal vs intertidal). Os indivíduos de H. mammata na Ria Formosa também eram maiores e com gónadas mais pesadas do que em Murcia e Olhos de Água, possivelmente ligado a diferenças n alimentação devido ao tipo de substrato (vasa/areia vs rochas). Estes resultados, incluindo o tamanho à primeira maturação e fecundidade, são importantes para a gestão das espécies nestas regiões. Além disso, sabendo quendo estas espécies se reproduzem permitiu determiner quando deviam ser feitos os bioensaios para estudar a comunicação química nos pepinos de mar. Os bioensaios tiveram como objectivo testar a hipótese de que os pepinos de mar libertam químicos durante a agregação e postura. Os resultados mostram que a água condicionada por machos, mas não homogenatos de gónada ou fluido celómico, atrai machos e fêmeas. Também, a água condicionada de macho, com ou sem espermatozóides, induziu a postura em ambos o sexos, sendo que a água de fêmea não teve qualquer efeito. Isto mostrou claramente que os machos atraem e induzem a postura em ambos os sexos. A água de macho foi analisada através de cromatografia líquida associada a espectrometria de massa, sendo identificada a presença de derivados de fosfatidil colina; contudo, a sua função potencial como feromonas necessita de confirmação experimental. As estruturas corporais em contacto difecto com o ambiente – os tentáculos, as papilas e os pés ambulacrários – e potencialmente envolvidos ma detecção de estímulos químicos foram caracterizadas através de histologia, histoquímica e imunocitoquímica para identificar terminais nervosos que pudessem ser utilizados para electrofisiologia e fazer a triagem dos possíveis coompostos feromonais. Não se encontraram diferenças óbvias na organização nervosa e tecidular. Contudo, o disco na extremidade destas estruturas parece ser um candidato promissor para ensaios electrofisiológicos futuros pois confirma-se ser a área snsorial de cada estrutura.Ó disco caracteriza-s por um arranjo nervoso específico, incluindo uma placa nervosa distinta, rica em óxido nitroso e contendo abundantes células, muitas das quais positivas para sinaptotagmina e serotonina, provavelmente neurónios sensoriais anteriormemte descritos. Finalmente, para melhor compreender como a percepção sensorial ocorre nos pepinos do mar, o reportório de receptores acoplados a proteínas G (GPCR) foram analisados em seis bibliotecas de transcriptómica de diferentes tecidos (tentáculos, ovário, testículo, cavidade oral, anel calcáreo, papila e tegumento). Foram identificados 591 GPCR através de pesquisa de sequências por semelhança; contudo não foram encontrados ortólogos de receptores de odorantes humanos. Através da análise filogenética, que incluiu sequências proteicas de humano, enguia anfioxo, ouriço marinho e anémona, pelo menos sete receptores de odorantes foram encontrados no pepino do mar. Estas sequências pertencem a dois grupos, um mais próximo do ouriço do mar e outro mais próximo da anémona, o que sugere origem de diferentes ancestrais. Foram encontrados amino ácidos conservados característicos da assinatura de receptores de odorantes de metazoários. Além disso, estes estavam presentes principalmente nos tentáculos, cavidade oral, anel calcário, papila e tegumento, em acordo com uma potencial função sensorial. No seu conjunto, esta tese fornece nova e importante informação para a gestão dos pepinos do mar e para melhor compreender como comunicam durante a reprodução