Identification and analysis of regulatory components of the mevalonate biosynthetic pathway in Arabidopsis thaliana using genetic approaches

Tese de doutoramento em Ciências (área de especialização em Biologia)The capacity of plants to survive under conditions of abiotic stresses is the result of complex and coordinated responses involving hundreds of genes. These responses are affected by interactions between different environmental factors and the developmental stage of the plant and could result in shortened life cycle, reduced or aborted seed production, or accelerated senescence. Drought or continuous water deficit is arguably one of the most important factors affecting plant growth, development, survival and crop productivity. The current marginal success in increasing crop yield under unfavourable environmental conditions is partially due to the large number of cellular processes affected by abiotic stresses which in turn cause severe impact on plant growth, development and finally production. Thus, an essential aspect of abiotic stress research in plants is to determine both, how plants sense and acclimate to abiotic stress conditions, and which are the genetic determinants involved in these processes. Significant progress has been made in understanding the physiological, cellular and molecular mechanisms of plant responses to environmental stress factors, and significant achievements with relevance to agriculture have been obtained, in many cases due to the use of Arabidopsis thaliana as a genetic model system in abiotic stress research. Arabidopsis has facilitated the functional characterization of numerous genes by use of loss- or gain-of-function experimental approaches. In a previously study, the Arabidopsis dry2/sqe1-5 mutant was isolated by its extreme sensitivity to drought stress. DRY2/SQE1-5 encodes a hypomorphic allele of the squalene epoxidase 1 involved in sterol biosynthesis. Further analysis of the dry2/sqe1-5 mutant indicated that this mutant is affected in the function of NADPH oxidases, revealling a central role the regulation of this pathway in drought tolerance and regulation of Reactive Oxygen Species (ROS) production. In the present work, to identify new regulatory components of the mevalonate (MVA) pathway in Arabidopsis, it was performed a suppressor screening of the dry2/sqe1-5 mutant, which is affected in the MVA pathway due to the decrease of the activity of the squalene epoxidase 1 (SQE1). Several mutants (named sud for suppressors of dry2 defects) that reversed most of the dry2/sqe1-5 developmental phenotypes, including drought hypersensivity were isolated and characterized, thus allowing the identification of new genetic components regulating the MVA pathway. In this pathway, the 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMGR) enzyme is located upstream of SQE1, and catalyzes a rate-limiting step of the MVA pathway from which isoprenoids and sterols are synthesized. In animals and yeasts, an essential regulatory mechanism of the MVA pathway is the ubiquitin-mediated degradation of HMGR by the Endoplasmic Reticulum- Associated Protein Degradation (ERAD) HRD pathway. Still, in plants very little is known about the regulatory mechanisms controlling HMGR activity. The analysis of four semidominant dry2/sqe1-5 suppressors led to the identification of SUD1, which encodes a protein showing sequence and structural homology to the E3 ubiquitin ligases involved in ERAD pathway. However, while in yeasts and animals the HMGR regulation occurs by controlling the protein stability through the HRD pathway, the regulation of HMGR in plants by SUD1 is exerted at the activity level by the alternative ERAD Doa10 pathway. Thus, this work contributed to the identification of common elements but mechanistic differences in HMGR regulation between plants, yeast and animals.A capacidade de plantas para sobreviverem em condições de stresse abiótico é o resultado de respostas complexas e coordenadas envolvendo centenas de genes. Estas respostas são afetados pelas interações entre os diferentes fatores ambientais e o estádio de desenvolvimento da planta e podem resultar no encurtamento do ciclo de vida, produção reduzida (ou mesmo inexistente) de sementes ou ainda senescência acelerada. A secura ou (ou deficit hídrico contínuo) é sem dúvida um dos fatores mais importantes que afetam o crescimento das plantas e, consequentemente a sobrevivência, desenvolvimento e produtividade das culturas de interesse. O escasso sucesso obtido no aumento da produtividade de cultivares de interesse, quando sujeitas a condições ambientais desfavoráveis deve-se, em parte, ao elevado número de processos celulares afetados pelo stresse abiótico, conduzindo à diminuição da produtividade vegetal. Assim, torna-se essencial na investigação sobre stresse abiótico em plantas, determinar como as plantas percecionam e se aclimatam a essas condições de stresse, e quais os determinantes genéticos envolvidos nestes processos. Progressos significativos na compreensão dos mecanismos fisiológicos, celulares e moleculares de respostas das plantas a fatores de stresses ambiental, e a aplicação deste conhecimento na agricultura têm sido obtidos e, em muitos casos, conseguidos devido ao uso de Arabidopsis thaliana como modelo de estudo. Com efeito, a utilização desta espécie tem permitindo a caracterização funcional de genes utilizando estratégias de ganho- ou de perda de função. Em trabalhos anteriores, o mutante de Arabidopsis dry2/sqe1-5 foi identificado através da sua extrema sensibilidade ao stresse hídrico. O gene DRY2/SQE1-5 codifica um alelo hipomórfico da enzima esqualeno epoxidase 1, envolvida na biossíntese de esteróis. Estudos ulteriores, efetuados neste mutante indicam que ele está afetado ao nível da atividade de NADPH oxidases, o que sugere fortemente um papel central da regulação da via biossíntética de esteróis na tolerância à secura e na produção de espécies reactivas de oxigénio. Neste trabalho, para identificar novos componentes reguladores da via do mevalonato (MVA) em Arabidopsis, foi realizado um rastreio de supressores do mutante dry2/sqe1-5, o qual está afetado ao nível da via do MVA, devido à diminuição da atividade da esqualeno epoxidase 1 (SQE1). Foram isolados e caracterizados vários mutantes sud (supressores dos defeitos de dry2) que revertem a maioria dos fenótipos de desenvolvimento do mutante dry2/sqe1-5, incluindo a hipersensibilidade à secura, permitindo a identificação de novos componentes genéticos reguladores da via do MVA. Nesta via metabólica, a enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A redutase (HMGR) está localizada a montante da enzima SQE1, e catalisa um passo limitante desta via, através da qual são sintetizados os isoprenóides e os esteróis. Em animais e leveduras foi já assinalado que um mecanismo de regulação essencial da via do MVA consiste na degradação, mediada por ubiquitina, da enzima HMGR (via HRD), ao nível da via de degradação de proteínas associada ao retículo endoplasmático (ERAD). Contudo, em plantas, permanece reduzido o conhecimento sobre os mecanismos reguladores que controlam a atividade da enzima HMGR. No presente trabalho, a análise de quatro supressores de dry2/sqe1-5 semidominantes conduziu à identificação de SUD1, que codifica uma proteína que apresenta homologia quer ao nível da sequência nucleotídica e aminoacídica quer ao nível estrutural com ubiquitina E3 ligases envolvidas na via ERAD em leveduras e em animais. Enquanto em leveduras e em animais a regulação da HMGR ocorre através do controlo da estabilidade da proteína, através da via HRD, em plantas, a regulação desta enzima por SUD1 é exercida ao nível da sua atividade, pela via ERAD alternativa Doa10. Os resultados obtidos no presente trabalho, contribuem significativamente para a identificação de elementos comuns, mas apresentando diferenças mecanísticas na regulação da HMGR entre plantas, fungos e animais