Functional analysis of STRIPAK complex components in the filamentous ascomycete Sordaria macrospora

Der STRIPAK (striatin-interacting phosphatase and kinase)-Komplex ist in Pilzen und Tieren konserviert. In dem filamentösen Askomyceten Sordaria macrospora ist der STRIPAK Komplex an der Hyphenfusion und Entwicklung von Fruchtkörpern beteiligt. Orthologe STRIPAK Proteine in S. macrospora umfassen PRO11 (striatin), PRO22 (STRIP1/2), die Gerüstuntereinheit der Serin-Threonin-Phosphatase SmPP2AA, die katalytische Phosphatase Untereinheit SmPP2Ac1 und den Kinase Aktivator SmMOB3. PRO11 und SmMOB3 sowie putative Interaktionspartner wurden affinitäts-chromatographisch angereichert, und massenspektrometrisch untersucht. Von mehreren spezifisch angereicherten Proteinen konnte ein Protein mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit als möglicher Interaktionspartner von PRO11 identifiziert werden. Dieses Protein wurde „STRIPAK complex interactor 1“ (SCI1) genannt. Für SCI1 wurden kleine „coiled-coil“ (CC) Domänen vorhergesagt. Auch in anderen Organismen assoziieren kleine „CC“ Proteine mit STRIPAK Komponenten. Obwohl diese kleinen „CC“ Proteine in STRIPAK Komplexen von Homo sapiens, Drosophila melanogaster, Saccharomyces cerevisiae und Schizosaccharomyces pombe entdeckt wurden, ist ihre Funktion weitgehend unerforscht. In dieser Studie wurde das kleine „CC“ Proteine SCI1 funktionell untersucht. SCI Proteine sind in filamentösen Askomyceten konserviert. In S. macrospora ist das Transkriptionslevel des sci1 Gens in der frühen sexuellen Entwicklung erhöht. Wie auch die anderen STRIPAK Gene, ist sci1 wichtig für die Hyphenfusion und die Entwicklung von Fruchtkörpern. Hefe-Zwei-Hybrid-Analysen zeigten, dass SCI1 oligomerisiert und auch mit PRO11 und PRO45 interagiert. In mikroskopischen Untersuchungen mit SCI1 oder PRO11 Fluoreszenzmarker-Fusionsproteinen, lokalisierten und kolokalisierten SCI1 und PRO11 an der Kernhülle. SCI1 wurde affinitäts-chromatographisch angereichert und die Proben mittels Massenspektrometrie auf potentielle Interaktionspartner untersucht. PRO11 wurde sehr stark angereichert. In mikroskopischen Untersuchungen von Fluoreszenzmarker-Fusionsproteinen, die Kerne, das Endoplasmatische Retikulum, Mitochondrien oder Aktin Polymerisation visualisierten, konnten keine Unterschiede zwischen dem Wildtyp und der sci1 S. macrospora Deletionsmutante festgestellt werden. Fluoreszenzmarker-Fusionsproteine eGFPZtRab5 und eGFPZtRab7 aus Zymoseptoria tritici, für frühe und späte Endosomen wurden in den Wildtyp und in die sci1 S. macrospora Deletionsmutante eingebracht um den Vesikeltransport zu untersuchen. Die Ergebnisse weisen drauf hin, dass der Vesikeltransport, welcher auch den Golgi Apparat einschließt in der sci1 Deletionsmutante gestört sind. Weiterhin wird eine Beteiligung von Mikrotubuli vermutet, entweder bei der Ladung von Fracht-Vesikeln auf Mikrotubuli oder direkt beim Tansport. Diese Studie zeigt zum ersten Mal, dass SCI1 ein Teil des STRIPAK Komplexes in S. macrospora ist. Weiterhin lassen die Ergebnisse dieser Studie darauf schließen, dass SCI1 und somit auch der STRIPAK Komplex in fundamentale Prozesse in eukaryotischen Zellen wie Kommunikation über längere Distanzen und Transport von Vesikeln beteiligt sind. Diese Prozesse stehen im engen Zusammenhang mit sexueller Entwicklung und Zellfusion und sind maßgeblich für das Verständnis normaler Zellfunktion in Pilzen und Tieren.The striatin-interacting phosphatase and kinase (STRIPAK) complex is conserved in fungi and animals. The STRIPAK in the filamentous ascomycete Sordaria macrospora, was previously found to be essential for hyphal fusion and fruiting-body development. STRIPAK orthologs in S. macrospora are PRO11 (striatin), PRO22 (STRIP1/2), PRO45 (SLMAP), the serine-threonine phosphatase scaffolding subunit PP2AA and the catalytic subunit SmPP2Ac1 as well as the kinase activator SmMOB3. In this study, PRO11 and SmMOB3 pull-down coupled to liquid chromatography and mass spectrometry (LC/MS) was performed and the LC/MS data was analyzed for putative interaction partners. Among, others an uncharacterized protein was identified as putative PRO11 interaction partner with very high confidence. The uncharacterized protein was named STRIPAK complex interactor 1 (SCI1). SCI1 is an ortholog of small coiled-coil (CC) domain(s) containing proteins found in STRIPAK complexes of yeasts, the fruit fly and mammals. Small CC proteins were discovered in the STRIPAK of Homo sapiens, Drosophila melanogaster, Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe, but their function in the individual STRIPAK complexes is hardly investigated. This study gives insights into the function of the small CC protein SCI1. The STRIPAK complex was also described in other filamentous fungi and this work shows that SCI proteins are conserved in filamentous ascomycetes. The sci1 gene is expressed during early developmental stages. Like other STRIPAK genes, sci1 is required for cell to cell fusion and sexual development in S. macrospora. Using yeast two-hybrid experiments oligomerization of SCI1, and direct interaction of SCI1 with PRO11 and PRO45 was shown. In fluorescence microcopy, fluorophore-tagged SCI1 and PRO11 fusion proteins showed that SCI1 colocalizes with PRO11 to the nuclear envelope. Additionally, proteins enriched in SCI1eGFP pull-downs were identified with LC/MS and PRO11 was highly enriched. Morphology of nuclei, the ER and mitochondria appeared normal in the S. macrospora sci1 deletion mutant in comparison to the wild type (wt). Also, actin polymerization in vegetative hyphae was similar. However, studies with eGFP-tagged reporter proteins of early and late endosomes of Zymoseptoria tritici, Rab5 and Rab7 respectively, in the S. macrospora sci1 deletion background strongly indicate a defect in vesicle and vacuolar transport. In this study SCI1 was also connected to the Golgi and might be important for vesicle or vacuole transport along microtubules. This is the first study, showing that SCI1 represents a component of the STRIPAK complex in S. macrospora. The results indicate that SCI1 and the STRIPAK complex are involved in fundamental processes in eukaryotic cells such as transport of vesicles and long distance transport. These processes are important for sexual development, cell fusion and give insights into normal cell function in fungi and animals