BT蛋白与水稻蛋白组的相互作用及其对转Bt基因水稻非预期效应研究

随着转基因生物研究的发展，转基因生物安全性问题受到了人们越来越多的关注，其中转基因植物的非预期效应是一个最难评价且争议最多的重要问题。目前，已有的研究主要是通过比较转基因植物及其受体亲本之间在表型性状等方面的差异来评估转基因植物的非预期效应。但是，对转基因植物非预期效应产生机制方面却难以给出明确的解释。<br> 本研究尝试改变以往的研究思路，从外源基因整合进植物基因组并表达外源蛋白这一确定的事件着手，研究外源蛋白与植物蛋白的相互作用，进而分析其非预期效应，从而可以明确非预期效应产生的分子机制。遵循此思路，本文研究了转Bt基因水稻中外源蛋白与水稻蛋白的相互作用，并分析了由此产生的非预期效应。<br> 首先，利用酵母双杂交方法以BT蛋白作为诱饵蛋白筛选了水稻的cDNA文库，最终筛选得到49种可以与BT蛋白发生相互作用的水稻蛋白，其中包括两个属于铁氧还蛋白家族的阳性蛋白——铁氧还蛋白结构域包含蛋白Fe①和Fe②。通过免疫共沉淀(Co-IP)实验进一步验证了Fe①和Fe②蛋白与BT蛋白之间相互作用的确定性。通过烟草叶肉细胞瞬时表达实验，确定了其在细胞中的定位:BT蛋白在细胞质和细胞核中表达，Fe①蛋白定位于叶绿体中，Fe②蛋白也在细胞质和细胞核中表达。<br> 然后，本研究进一步克隆了水稻中与Fe①和Fe②蛋白高度相似且已知功能的两类主要的铁氧还蛋白（叶型铁氧还蛋白Fd-L和根型铁氧还蛋白Fd-R），并研究了它们与BT蛋白的相互作用。利用酵母双杂交和Co-IP方法确定了Fd-L和Fd-R与BT蛋白之间存在相互作用;定位实验表明，Fd-L和Fd-R分别定位于叶绿体和质体。<br> 由于Fd-L是水稻叶片细胞叶绿体类囊体膜上参与光合磷酸化电子传递链的重要蛋白，所以本文进一步研究了BT蛋白与Fd-L的相互作用对水稻光合作用的影响。微测量结果表明，在初苗时期转Bt基因水稻BT-T51-1叶片在相同的光强条件下H+的内流量显著低于其受体亲本水稻MH63，说明BT-T51-1的光合作用效率低于MH63。同时发现，水稻发芽后22天以内BT-T51-1的株高显著低于MH63，说明转Bt基因水稻幼苗的生长过程受到了影响。转Bt基因水稻的这种非预期效应极有可能是由于BT蛋白与水稻Fd蛋白发生相互作用而产生的。<br> 本研究所建立的研究方法可以应用于转基因生物安全预评价体系中，在转基因植物研发前即可评估外源蛋白与受体植物蛋白组的相互作用以及由此产生的非预期效应，为转基因生物安全评价提供科学的依据。