Identifizierung von Regulatoren der Tumorgefäßmorphologie

In contrast to normal vessels, tumor vasculature is structurally and functionally abnormal. Tumor vessels are highly disorganized, tortuous and dilated, with uneven diameter and excessive branching. Consequently, tumor blood flow is chaotic, which leads to hypoxic and acidic regions in tumors. These conditions lower the therapeutic effectiveness and select for cancer cells that are more malignant and metastatic. The therapeutic outcome could be improved by increasing the functionality and density of the tumor vasculature. Tumor angiogenesis also shows parallels to epithelial to mesenchymal transition (EMT), a process enabling metastasis. Metastasis is a multi-step process, during which tumor cells have to invade the surrounding host tissue to reach the circulation and to be transported to distant sites. We hypothesize that the variability in the phenotype of the tumor vasculature is controlled by the differential expression of key transcription factors. Inhibiting these transcription factors might be a promising way for angiogenic intervention and vascular re-engineering. Therefore, we investigated the interdependence of tumor-, stroma- and immune cell-derived angiogenic factors, transcription factors and resulting vessel phenotypes. Additionally, we evaluated whether transcription factors that regulate EMT are promising targets for vascular remodeling. We used formalin fixed paraffin embedded samples from breast cancer patients, classified according to estrogen-, progesterone- and human epidermal growth factor receptor (HER) 2 status. Establishing various techniques (CD34 staining, laser microdissection, RNA isolation and expression profiling) we systematically analyzed tumor and stroma-derived growths factors. In addition, vascular parameters such as microvessel size, area, circularity and density were assessed. Finally the established expression profiles were correlated with the observed vessel phenotype. As the SNAI1 transcriptional repressor is a key regulator of EMT, we examined the effect of vascular knockdown of Snai1 in murine cancer models (E0771, B16-F10 and lewis lung carcinoma). Among individual mammary carcinomas, but not among subtypes, strong differences of vascular parameters were observed. Also, little difference between lobular carcinomas and ductal carcinomas was found. Vessel phenotype of Her2 enriched carcinomas was similar to that of lobular carcinomas. Vessel morphology of luminal A and B and basal-like tumors resembled each other. Expression of angiogenic factors was variable across subtypes. We discovered an inverse correlation of PDGF-B and VEGF-A with vessel area in luminal A tumors. In these tumors expression of IL12A, an inhibitor of angiogenesis, was also correlated with vessel size. Treatment of endothelial cells with growth factors revealed an increased expression of transcription factors involved in the regulation of EMT. Knockdown of Snai1 in endothelial cells of mice increased tumor growth and decreased hypoxia in the E0771 and the B16-F10 models. In the lewis lung carcinomas, tumor vascularity and biodistribution of doxorubicin were improved. Here, doxorubicin treatment in combination with the endothelial cell-specific knockdown did slow tumor growth. This shows that SNAI1 is important for a tumor's vascularization, with the significance of its role depending on the tumor model. The methods established in this work open the way for the analysis of the expression of key transcription factors in vessels of formalin fixed paraffin embedded tumors. This research enables us to find novel targets for vascular intervention and to eventually design novel targeted drugs to inhibit these targets.In Tumoren, im Vergleich zu gesundem Gewebe, sind Aufbau und Funktionsweise von Blutgefäßen abnormal. Tumorgefäße sind unorgansiert, stark gewunden und geweitet, und weisen einen ungleichmäßigen Durchmesser sowie häufige Verzweigungen auf. Die chaotische Durchblutung führt zu hypoxischen und sauren Regionen. Diese abnormale Gefäßstruktur verringert sowohl die Einbringung, als auch die Wirksamkeit von Medikamenten und fördert zudem Invasivität und Metastasierung. Die Tumorbehandlung könnte durch eine "Normalisierung" der Gefäße sowie durch die Verbesserung der Dichte der Tumorblutgefäße erleichtert werden, da Medikamente so leichter das Tumorzentrum erreichen. In Tumoren weist der Prozess der Angiogenese Parallelen zur epithelial-mesenchymalen Transition (EMT) auf. Die EMT spielt eine zentrale Rolle bei der Metastasierung. Hierbei handelt es sich um einen mehrstufigen Prozess, bei dem Tumorzellen in das umgebende Wirtsgewebe eindringen um den Blutkreislauf zu erreichen und so zu weiter entfernten Organen zu gelangen. Laut unserer Hypothese werden die unterschiedlichen Phenotypen der Tumorblutgefäße durch die Expression verschiedener Schlüssel-Transkriptionsfaktoren kontrolliert. Die Hemmung dieser Transkriptionsfaktoren wäre folglich eine vielversprechende Möglichkeit in die Gefäßsturktur einzugreifen und sie zu restrukturieren. Deshalb wurde die Wechselwirkungen zwischen angiogenen Faktoren, die von Tumorzellen, Stromazellen und Zellen des Immunsystems abgesondert werden und Transkriptionsfaktoren sowie den resultierenden Gefäßphenotypen untersucht. Zudem wurde evaluiert, ob Transkriptionsfaktoren, die bei der EMT von Bedeutung sind, ein therapeutisches Ziel zur Umorganisation der Gefäßstruktur darstellen könnten. Für diese Studie wurden humane, in Formalin fixierte und in Paraffin eingebette, Proben von Brustkrebspatienten verwendet. Diese Proben wurden anhand des Rezeptorstatus von Östrogen-, Progesteron- und humanem epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (HER) 2 in tumorbiologische Untergruppen eingeordnet. Die Etablierung verschiedener Techniken (CD34 Gewebefärbung, Laser-Mikrodissektion, RNA-Isolierung und Erstellung von Expressionsprofilen) ermöglichte es, systematisch Wachstumsfaktoren, die von den Tumoren und ihrem umgebenden Stroma sezerniert werden, zu analysieren. Zusätzlich untersuchten wir vaskuläre Parameter wie Gefäßgröße, -fläche, -dichte und -zirkularität. Schließlich wurden die erstellten Expressionsprofile mit den Gefäßeigenschaften korreliert. In verschiedenen murinen Krebsmodellen (E0771, B16-F10 und Lewis-Lungenkarzinom) untersuchten wir die Auswirkung der Herrunterregulierung des Transkriptionsfaktors SNAI1 in Blutgefäßen. SNAI1 spielt eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der EMT. Es zeigte sich, dass die einzelnen Brustkrebsproben sich bezüglich der untersuchten Gefäßparameter stark voneinander unterschieden. Zwischen den Subtypen hingegen waren keine Unterschiede zu sehen. Lobuläre und duktale Karzinome unterschieden sich kaum voneinander. Der Gefäßphenotyp der HER2-positiven Proben ähnelte dem der lobulären. Des Weiteren ähnelten sich Karzinome vom Luminal A- und B-Typ so wie vom Basal-Zell-Typ in ihrer Gefäßmorphologie. Das Expressionsmuster der Wachstumsfaktoren variierte von Tumor zu Tumor und innerhalb der Subytpen. Es stellte sich heraus, dass die Expression von PDGF-B und VEGF-A im Subtyp Luminal A invers mit der Gefäßfläche korreliert ist. Außerdem war in dieser Gruppe die Expression des Angiogenese-Hemmers IL-12A direkt mit der Gefäßgröße korreliert. Die Behandlung von Endothelzellen mit Wachstumsfaktoren zeigte eine erhöhte Expression von Transkriptionsfaktoren, die an der Regulierung der EMT beteiligt sind. Die Herrunterregulierung von Snai1 in Endothelzellen im Tierversuch führte zu einer Zunahme des Tumorwachstums sowie zu einem Rückgang der Hypoxie in den Tumormodellen E0771 und B16-F10. In den Lewis-Lungenkarzinomen kam es zu einer Verbesserung der Blutgefäßmorphologie und der Verteilung von Doxorubicin im Tumorgewebe. Die Therapie mit Doxorubicin in Kombination mit der endothellzell-spezifischen Herrunterregulierung von Snai1 zeigte zudem eine stärkere Hemmung des Tumorwachstums. Die Methoden, die in dieser Arbeit etabliert wurden, ermöglichen die Analyse der Expression von Schlüssel-Transkriptionsfaktoren in den Gefäßen von Formalin fixierten und in Paraffin eingebetten Proben. Dies macht es wiederum möglich neue Angriffspunkte für die Gefäßmodulation zu finden und schlußendlich neue, darauf gerichtete Medikamente zu entwickeln