The role of the VEGF-receptors in the peripheral circulation of the rabbit

Gefäßverschlußkrankheiten stellen die Haupttodesursache in den westlichen Industrienationen dar. Trotz vielfältiger, kostenintensiver chirurgischer Interventionsmaßnahmen ist die post-operative Rezidivrate hoch. Zudem besteht für viele Patienten keine Möglichkeit zum Eingriff. So wurde viel Hoffnung in die exogene Stimulierbarkeit endogener Gefäßadaptationsprozesse durch endotheliale Wachstumsfaktoren gesetzt. Diese sollen das Wachstum neuer Gefäße induzieren, welche eine verschlossene Arterie ersetzen können. Dies kann durch endotheliale Aussprossung von Kapillaren geschehen (Angiogenese) oder durch das Auswachsen präexistierender arterio-arteriolarer Verbindungen zu großen konduktiven Kollateralarterien (Arteriogenese). Die muskulären Umgehungsstraßen sind bei weitem effektiver als ein kleinlumiges Kapillargeflecht, um minderperfundierte Gewebe nach Gefäßverschluß ausreichend mit Blut zu versorgen. Zudem können muskuläre Arterien aktiv auf Bedarfsänderungen im Rahmen der Blutversorgung reagieren und sich durch luminale Erweiterung (Vasodilatation) anpassen. So wurden bereits infolge Kollateralisierung im Herzen nicht-klinische Gefäßverschlüsse zufällig bei Untersuchungen entdeckt. Im Rahmen des Kollateralwachstums wurde viel über die Rolle der Angiogenese-faktoren aus der VEGF-Familie diskutiert. Infolge unterschiedlichem Splicings oder Degradation der Primär mRNA existieren mehrere Formen von VEGF, so der Placenta Growth Factor (PlGF), VEGF A-E. Aufgrund der hervorragenden Wirkung der 165 Aminosäuren großen Isoform von VEGF-A (VEGF165) in einigen Tiermodellen, nahm man an, dieses Glykoprotein sei das herausragende Molekül für die Stimulierung der Arteriogenese. Jedoch versagte es in seiner ersten klinischen Phase II Studie. Daher wurde in dieser Dissertation die Rolle des endothelialen VEGFR-2 mit der des monozytären VEGFR-1 im Rahmen des Kollateralwachstums verglichen. Neben VEGF, der Agonist beider Rezeptoren ist, wurde sein selektiv den VEGFR-1 bindendes Homolog PLGF-2 und der ausschließlich VEGFR 2 aktivierende VEGF-E in den Kollateralkreislauf infundiert. Somit bestand die Möglichkeit zur Differenzierung zwischen endothelialen und monozytären Prozessen im Rahmen des Gefäßwachstums nach arteriellem Gefäßverschluß. Vielmehr sollte untersucht werden, welcher Prozeß ein stärkeres Kollateralwachstum und somit eine Verbesserung der Blutzufuhr zum ischämischen Gewebe bewirken kann. Zur quantitativen Analyse wurde ein neues in vivo Hämodynamikmodell in der Femoralis-ligierten Kaninchenhintergliedmaße etabliert, welches zur Bestimmung des Kollateralflusses mit perivaskulären, auf Ultraschall basierenden, Flußmeßsonden arbeitet. Es mißt den dem Kollateralfluß entsprechenden Blutfluß zur Hintergliedmaße in der A. iliaca externa und den Druckgradienten entlang des Kollateralsystem um die Verschlußstelle herum. Hieraus kann in vollständiger Vasodilatation die maximale kollaterale Konduktanz errechnet werden. Dieser hämodynamische Parameter korreliert mit dem Fließwiderstand und somit mit dem Kollateralwachstum. Das hier beschriebene Modell ist dem auf der Mikrosphären-Technik basierenden Vorläufermodell überlegen. Mikrosphärentechniken bergen die Gefahr der Fehlmessung, da nur einzelne Muskelproben stellvertretend für die Blutzufuhr zur ganzen Gliedmaße analysiert werden. Die Messung in der A. iliaca externa dagegen erfaßt den vollständigen Blutfluß zur Hintergliedmaße. Die mit dem neuen Modell erhaltenen hämodynamischen Ergebnisse und zusätzlich postmortal angefertigte Angiographien nach einer Woche lokaler Applikation zeigten, daß zwar der VEGFR-1-spezifische PlGF 2 nicht aber der VEGFR-2-spezifische VEGF-E wesentlich zum Kollateralwachstum beitragen. Die Resultate mit PlGF-2 fielen sogar höher als mit dem beide Rezeptoren bindenden VEGF aus. Die Experimentalergebnissse beweisen die herausragende Rolle von VEGFR-1 auf Monozyten im Rahmen der Stimulation des Kollateralwachstums. Die Aktivierung des endothelialen VEGFR-2 erwies sich nicht nur als ungeeignet zur Verstärkung der Arteriogenese, sie hemmte sogar ihren Verlauf. Die Kombination aus VEGF-E und PlGF-2 erzielte nicht die Wirkung von PlGF-2 alleine. Demnach scheint keine Notwendigkeit für eine Kooperation der beiden VEGF-Rezeptoren im Rahmen der Arteriogenese zu bestehen. Zusätzlich konnte eine Akkumulierung von aktivierten Monozyten/Makrophagen in der Peripherie von Kollateralgefäßen nach Gabe von PlGF-2 beobachtet werden. Zusammengefaßt läßt sich somit sagen, daß die mit dem für VEGFR-1 spezifischen PlGF-2 dokumentierte arteriogene Wirkung durch dessen Monozyten-aktivierende Eigenschaft bedingt ist. Daher scheint die Stimulierung des Kollateralwachstums durch die Aktivierung von Monozyten ein effektiver Weg zur Behandlung von Gefäßverschlußerkrankungen zu sein.Obstructive vessel diseases are the most common reason causing death in the industrialized western world. Despite many expensive surgical interventions the post-operative relapses remain high. Furthermore, many patients cannot be treated by an surgical intervention, which in itself posses high risks. The exogenous stimulation of the endogenous vascular adaptation process by endothelium-specific growth factors was considered to be an effective strategy for future treatments. These would induce the de novo growth of vessels, thus replacing an occluded artery. This can be achieved by endothelial sprouting of capillaries (angiogenesis) or through outgrowth of pre-existent arterio-arteriolar connections into big conductive collateral arteries (arteriogenesis). These muscular highways are more effective than a small capillary plexus in meliorating the needs of ischemic tissue below vessel obstruction. Besides, muscular arteries actively react on changes in blood demand by dilatation. Thereby, a number of patients has been described lacking typical clinical signs despite having severe coronary stenosis. The role of VEGF-family-members as inducer of collateral growth has been frequently discussed. Following differential splicing and degradation of the mRNA several homologa of VEGF exist, such as Placenta Growth Factor (PlGF), VEGF A-E. Because of its pronounced effects in various animal models, the 165-amino-acid isoform of VEGF-A (VEGF165) has been supposed to be the outstanding molecule for therapeutic vessel growth. However, it failed to stimulate vessel growth in its first Phase II clinical study. Therefore the impact of its two signaling receptors in the vasculature on arteriogenesis had to be examined. Besides VEGF, its homologue PlGF-2, which only binds to VEGFR 1 and VEGF-E, which only recognizes VEGFR-2 were infused into the collateral circulation. Therewith, endothelial and monocyte-mediated processes which participate in collateral growth following arterial occlusion could be differentiated. However, it had to be examined which process was more important for collateral growth, thus leading to an improved blood supply to ischemic tissues. As a first step, a novel in vivo hemodynamic model for the determination of collateral-related blood flow was established in the ischemic rabbit hind limb, using perivascular ultrasonic flowprobes. External iliac blood flow, which was equivalent to collateral blood flow, as well as the pressure gradient along the collaterals was measured and the maximal collateral conductance was calculated at maximal hyperemia. This hemodynamic parameter correlates with the collateral resistance and is thereby related to arteriogenesis. The here described hemodynamic model is more favourably than the previously described model based on microsphere technique. As only a few muscle samples are taken for flow analysis of the whole hind limb, analysis errors may occur easily. Iliac flow, however, describes total blood flow to the hind limb. The hemodynamic data and additional postmortal angiographies after one week of local application demonstrated that the VEGFR-1 specific PlGF-2 significantly contributed to arteriogenesis but not the VEGFR-2 specific VEGF-E. The results with PlGF-2 even surpassed those of VEGF, the ligand for both receptors. The experimental findings provide evidence for the dominant role of VEGFR-1 on monocytes in therapeutic arteriogenesis. The stimulation of endothelial VEGFR-2 not only failed to improve collateral growth, it even counteracted the process of arteriogenesis as the combination of VEGF-E and PlGF-2 did not exceed the effect of PlGF-2 alone. These results indicate that cooperation of the two VEGF-receptors in endothelial cell signaling is not required for arteriogenesis. In addition, accumulation of activated monocytes/macrophages in the periphery of collateral vessels in PlGF-2 treated animals was observed. Together, these data indicate that the arteriogenic activity observed with the VEGFR-1 specific PlGF-2 is caused by its monocyte activating properties. Therefore the stimulation of collateral vessel growth via monocyte activation seems to be the more promising way for treatment of ischemic diseases