小龙虾病毒(PCV)形态学观察及益生菌抗鲫疱疹病毒(CaHV)作用分析

病毒是严重危害水产养殖的主要病原，如小龙虾病毒（Procambarus clarkia virus, PCV）、鲫疱疹病毒（Carassius auratus herpesvirus, CaHV）和大鲵蛙病毒（Andriasda vidianus ranaviurs, ADRV）等，引起宿主严重疾病和高死亡率。本论文对此开展显微与超微观察、抗病毒作用分析及病毒基因克隆与表达等相关研究，结果如下：1、自然感染小龙虾组织内病毒的分布和形态学观察。从养殖小龙虾大量死亡区域收集幸存小龙虾，进行病原检测、分离及观察。对体表无可察症状的小龙虾组织进行显微观察，结果显示肝胰腺小管细胞坏死、核固缩、小管内壁损坏且细胞破碎；鳃组织肿胀、充血、毛细血管扩张。超微切片观察显示：在感染的小 龙虾细胞中存在大量两端钝圆、有囊膜的、平均直径约为252× 104 nm的杆状病毒颗粒，在肝胰腺细胞中病毒颗粒呈聚集状分布，而在鳃和肠的细胞核中病毒以包涵体的形式存在。负染电镜显示，该病毒有尾附器，核衣壳平均直径约为210 × 80 nm，包含垂直于纵轴的14节组成，每节包含两条平行的条纹，具有线头病毒科的典型特征。经病毒纯化并SDS-PAGE分析获得包含预测膜蛋白和衣壳蛋白在内的病毒结构蛋白图谱，与白斑病毒属代表株（WSSV-CN）比较，在感染引起宿主的病症和病毒结构蛋白均有不同。2、益生菌丁酸梭菌（Clostridium butyrium, Cb）调节鲫免疫增强抗鲫疱疹病毒（CaHV）能力。通过分离一株益生菌丁酸梭菌（Clostridium butyrium，Cb-F1610，CCTC:M2016587）及使用Cb喂饵鲫，对其产生抗鲫疱疹病毒（CaHV）效果进行测试。实验分为四组，Cb+V组为添加益生菌免疫后进行疱疹病毒感染；V组为不添加益生菌直接进行疱疹病毒感染；Cb组为添加益生菌不进行疱疹病 毒感染；Con组为空白对照组。同时对鲫免疫相关基因（IL11, IRF7, PKR和Mx）和病毒主要衣壳蛋白基因（MCP）进行定量PCR检测。结果显示鲫感染CaHV后3天开始死亡，Cb+V组的累计存活率为45%，而V组的累计存活率为11%，Cb组和Con存活率为100%，显示丁酸梭菌具有明显的免疫保护作用。定量PCR结果显示在感染3天的后Cb+V组MCP拷贝数明显低于V组，宿主免疫相关基因表达量Cb+V组明显高于V组，显示在病毒感染的早期阶段益生菌能促进宿主免疫应答，增强宿主的抗病毒能力。3、大鲵蛙病毒 (ADRV) 感染相关基因—6R的克隆、原核表达及其产物。在已报道大鲵蛙病毒（Andriasda vidianus ranaviurs, ADRV）基因组的基础上，对ADRV 6R 进行了克隆、原核表达及其产物的分离，这是一个经生物信息分析表明与病毒感染相关的功能基因。先经PCR 扩增长到711 bp的ADRV 6R，构建含扩增片段的克隆质粒pMD18-T-6R。再构建原核表达质粒 pET-32a-6R, 进行测序， 并与水生动物蛙病毒相关基因同源序列进行比对，该扩增片段与预期一致，其编码分子量约为27 kDa、含236 个氨基酸的蛋白，与水产动物病毒US22 蛋白家族 (US22 family protein) 成员有很高的同源性。然后对pET-32a-6R 进行转化、诱导表达, 并利用Ni-NTA His-Bind 亲和层析及不同浓度咪唑洗脱液对表达产物进行分离、电泳分析，结果显示，获得与预测分子量相符的45 kDa 融合蛋白(27 kDa 目的蛋白与18 kDa His 标签)。这为后续制备抗体、并开展大鲵蛙病毒与宿主的相互作用研究提供了有用的实验材料