Synaptic Vesicles, Mitochondria, and Actin Alterations in SMN-deficient Mice

Proximale Spinale Muskel Atrophie (SMA) ist eine autosomal rezessive Krankheit, charakterisiert durch eine Degeneration des zweiten Motorneurons und einer progressiven Paralyse und Atrophie proximaler Muskeln. Nach Zystischer Fibrose, ist SMA die häufigste autosomal rezessive Erkrankung bei Menschen und der häufigste genetische Grund für Säuglingssterblichkeit. SMA, monogenetisch im Ursprung, ist verursacht durch eine Mutation in einem einzelnen Gen, dem Survival Motor Neuron 1 (SMN1) Gen, was zu einer reduzierten Menge an Survival Motor Neuron (SMN) protein führt. SMN ist ein ubiquitär expremiertes Protein mit house-keeping Funktion in snRNP Biogenese und pre-mRNA splicen. Dennoch, eine reduzierte Menge an SMN beeinträchtigt vor allem Motor Neurone und Muskeln aus bisher unverständlichen Gründen. Es wurde demonstriert, dass SMN mit ß-actin mRNA interagiert und an dessen Transport entlang des Axons beteiligt ist. Funktionelle Studien an der Neuromuskulären Synapse (NMJ) haben gezeigt, dass Evozierte Neurotransmitterfreisetzung um 55 % reduziert war in den meist betroffenen Muskelgruppen, dies indiziert, dass eine verringerte Menge an Vesikeln fusioniert, währenddessen asynchrone Transmitterfreisetzung um 300 % erhöht ist aufgrund von einer abnormalen Akkumulation von Calcium in der Nervenendigung in SMA Mäusen. Eine Mögliche Erklärung für diese Calcium Erhöhung ist eine herabgesetzte Calcium Aufnahme durch Mitochondrien während Serien von Aktions Potenzialen. Diese Studie präsentiert eine umfassende Analyse mit einem Fluoreszens Konfokal Mikroskop über die Organisation und Fülle Synaptischer Vesikel (SVs), Mitochonrien und Aktin in Nervenendigungen von SMA Mäusen ( Smn -/-; SMN2; SMNdelta7). Wir visualisierten Synaptische Vesikel mit einem Antikörper gegen den Acetylcholin ( VACht) und konnten zeigen, dass im Transversus Abdominis (TVA) Muskel SV Klusters während des Reifungsprozesse klein verbleiben mit einer Reduzierung von 50% der totalen Fläche die von SVs bedeckt ist. Diese schwere Reduktion von SVs wurde auch im der kaudalen Muskelstrang des Levator auris longus (LAL) Muskel gefunden, obwohl nur leichte Veränderungen in der Postsynapse dieses Muskels festzustellen sind. Diese Ergebniss von Präsynaptischer Pathologie, neben fast normalen postsynaptischen Status, verstärkt die Hypothese dass SMN-induzierte Veränderungen im Muskel nicht auschließlich eine reine Konsequenz von Motor Neuron Degeneration sein können. Als Nächstes, haben wir Mitochondria mit Mitotracker angefärbt und haben gefunden, dass die Fläche,die von Mitochondrien in Mutanten Mäusen bedeckt ist, etwa nur die Hälfte der Fläche im Wild typ beträgt. Überraschenderweise waren SVs und Mitochondrien stak kolokalisiert. In vielen Fällen war ein Kern von Mitochondrien deutlich umgeben von einem Ring aus SVs. Diese Verteilung war unbeeinträchtig in der Mutanten Maus und könnte eine mehr generelle Bedeutung in Nervenendigungen haben. Phalloidin gefärbtes Aktin zeigte das F-aktin ringförmige Strukturen um SV Klusters formt. Diese Strukturen und der Prozentuale Anteil der Nervenendigung der von Aktin bedeckt ist, war geringer in SMA Mutanten Mäusen. Aktin ist an multiblen Schritten des Vesikel Zyklus beteiligt. Kurz Strecken-Transport von Vesikeln und Organellen, wie Mitochondrien in Wachstunskegeln und Nervendigungen ist vor allem vom aktin-myosin-basierten Transport abhängig. Weitere Arbeit ist notwendig um zu klären ob die Charakteristiken des SMA Phänotyps wie abnormales SV Klustering, Reduktion von Mitochondrien, unabhängig auftreten oder eine gemeinsame Konsequenz von einer Dysfunktion des Aktin Zytoskeleton sind, was Aktin eine Schlüsselrolle in der SMA Pathogenese verleihen würde.Proximal spinal muscular atrophy (SMA) is an autosomal recessive disorder characterized by degeneration of the second motor neurons and progressive paralysis with atrophy of the proximal muscles. After cystic fibrosis, SMA is the most common autosomal recessive disorder in humans and the most common genetic cause for infant mortality. SMA, monogenic in origin, is caused by a mutation in a single gene, the Survival of Motor Neuron 1 (SMN1) gene, which leads to reduced levels of Survival Motor Neuron (SMN) protein. SMN is a ubiquitously expressed protein with house-keeping roles in snRNP biogenesis and pre-mRNA splicing. However, reduced levels of SMN predominantly affect motor neurons and muscles for reasons that are poorly understood. It was shown that SMN interacts with β-actin mRNA and mediates its transport along the axon. Functional studies at neuromuscular junctions (NMJ) revealed that the evoked neurotransmitter release was decreased by approximately 55% in most affected muscles, indicating a decreased number of fused vesicles, while asynchronous release is increased by 300% due to an anomalous accumulation of intraterminal bulk Ca2+ in SMA mice. A possible explanation of this augmentation is a decreased Ca2+ reuptake by mitochondria during trains of action potential. This study presents a comprehensive fluorescent confocal microcopy analysis of the organization and abundance of Synaptic Vesicles (SVs), mitochondria, and actin in nerve terminals of SMA mice (Smn -/-; SMN2; SMN∆7). We visualized SV clusters with an antibody against the vesicular acetylcholine transporter (VAChT) and could show that in Transversus abdominis (TVA) muscle SV clusters remain small during maturation with the total area covered by SVs reduced by 50%. This severe reduction of SVs was also found in the caudal band of the Levator auris longus muscle (LAL). However, only modest abnormalities at the postsynaptic side were detectable in this muscle. This finding of presynaptic pathology, despite an almost normal postsynaptic status, supports the hypothesis that SMN-induced changes in muscle cannot be solely attributed to motor neuron degeneration. Next, we stained mitochondria with mitotracker and found that the area covered by mitochondria in mutants was about half compared to wild type. Surprisingly SVs and mitochondria were strongly colocalized. In many cases a core of mitochondria was clearly surrounded by a SV rim. This spatial organization was not altered in mutants and might be of general relevance for the functional integrity in nerve terminals. Phalloidin stains of F-actin showed that F-actin forms ring-like structures around SV clusters. These structures and the percentage of the terminal area covered by actin, normalized to the postsynaptic area, were smaller in mutant mice. Actin is implicated at multiple steps of the synaptic vesicle cycle. Short range movement of vesicles and organelles, such as mitochondria at growth cones and nerve terminals, depends primarily on actin-myosin-based transport. Further work is required to clarify whether the characteristics of the disease phenotype described here, such as abnormal SV clustering and reduction of mitochondria, occur independently or are the common consequence of dysfunction of the actin cytoskeleton, which would assign a key role in SMA pathogenesis to actin.2015-06-0