Investigating the Chloride dependence of the Sulfate-Anion-Transporter 1

Die Expression von natriumabhängigen und natriumunabhängigen Transportern für Sulfat in Nieren und Leber ist für die Sulfathomöostase unabdingbar. Ein natriumunabhängiger Transporter für Sulfat ist der Sulfat-Anionen-Transporter 1, sat-1, der Sulfat im Austausch gegen Oxalat, Bicarbonat, Chlorid und Glyoxylat sowohl in die Zellen aufnehmen als auch in das Blut abgeben kann. In dieser Arbeit wurde die Transportfunktion des Sulfat-Anionen-Transporters 1 der Ratte, rsat-1, untersucht. Das Ziel war eine genauere Kenntnis über den Einfluss von Chlorid, des intrazellulären pH-Wertes und der extrazellulären Calciumkonzentration auf den Sulfattransport durch rsat-1 zu erlangen. Als Expressionssystem für rsat-1 wurden Oozyten des Krallenfrosches Xenopus-laevis verwendet. Elektrophysiologische Versuche, die im „Current-Clamp-Modus“ durchgeführt wurden, ermöglichten die Messung von substratinduzierten Potentialänderungen. Durch radiochemische Versuche konnte die Sulfataufnahme durch sat-1 unter variierenden Bedingungen bestimmt werden. Die Rolle des Chlorids in Hinblick auf den Sulfattransport durch sat-1 konnte nicht gänzlich geklärt werden. Da Thiosulfat und Nitrat in den durchgeführten Versuchen die Aufnahme von [35S]Sulfat über rsat-1 hemmten, könnte das Stickstoffatom den Transport von Sulfat beeinflussen. Intrazellulär an Chlorid verarmte rsat-1-exprimierende Oozyten nahmen in den durchgeführten Versuchen vermehrt [35S]Sulfat auf. Des Weiteren konnte eine Steigerung der [35S]Sulfataufnahme in chloridreduzierten, gluconat- beziehungsweise mannithaltigen Lösungen beobachtet werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit sind mit einer allosterischen oder kompetitiven Hemmung der Aufnahme von Sulfat durch Chlorid vereinbar. Eine genauere Untersuchung des Chloridtransports über sat-1 wäre durch Versuche mit radioaktiv markiertem Iod¹²⁵ möglich, das wie Chlorid transportiert wird. Die intrazelluläre Ansäuerung der Oozyten durch Ammoniumchlorid führte zu einer erhöhten [35S]Sulfataufnahme in die rsat-1-exprimierenden Oozyten. Diese könnte durch eine verminderte Bicarbonatkonzentration an der äußeren Zellmembran mit einer reduzierten kompetitiven Hemmung begründet sein. Ebenso könnte Ammoniumchlorid durch eine protonierende Wirkung eine Konformationsänderung mit einer Affinitätssteigerung von sat-1 für Sulfat zur Folge haben. Mit steigender Calciumkonzentration wurde die Depolarisation rsat-1-exprimierender Oozyten in chloridreduzierten und gluconathaltigen Lösungen geringer. Dies ist mit bereits vorliegenden Daten vereinbar, in denen Xenopus laevis Oozyten in chloridreduzierten Medien depolarisieren.The sulfate-anion-transporter-1 is localized in the basolateral membrane of the proximal tubular cells and the sinusoidal membrane of hepatocytes. Earlier studies showed species differences with respect to chloride transport since chloride is transported both by sat-1 in mice and humans but it is yet unclear whether chloride is transported by rat sat-1 or how it influences sulfate transport by rsat-1. To investigate whether chloride is transported by rsat-1, [35S]sulfate uptake in Xenopus laevis oocytes was examined under various experimental conditions. In solutions containing a reduced chloride concentration [35S]sulfate uptake was enhanced in the presence of gluconate and mannite whereas it was inhibited in presence of thiocyanate and nitrate. Intracellular reduction in chloride enhanced [35S]sulfate uptake in rsat-1 expressing oocytes. Electrophysiological studies provided evidence that sat-1 is an electroneutral transporter. Furthermore the rsat-1 expressing oocytes depolarized under perfusion with gluconate containing media with a reduced chloride concentration and hyperpolarized in thiocyanate and nitrate containing media. Oocytes that were reduced in intracellular chloride concentration did not show any time dependent changes in the membrane potential after incubation in solutions reduced in chloride for different periods of time. These data could be compatible with an inhibition of rsat-1 by chloride. Further studies could be done using I125 as it is selectively transported by chloride-transporters. Considering other ions the sat-1 expressing oocytes showed an increased [35S]sulfate uptake after intracellular acidification by incubation in ammonium chloride containing solutions which could be due to a reduced inhibition by bicarbonate or changes in conformation by protonation. Both rsat-1 and water injected oocytes depolarized under calcium reduced conditions. These results show that the membrane potential of Xenopus oocytes is highly dependent on the extracellular calcium concentration.2013-05-0