Identifizierung und Charakterisierung von ADNP als neuer Faktor im Heterochromatin

In eukaryotischen Zellen ist die genetische Information in Form von langen, linearen DNA Molekülen im Zellkern gespeichert. Zeit- und Gewebespezifische Genexpressionsmuster werden durch die Kombination von DNA mit Proteinen manifestiert, was zu einer Struktur namens Chromatin führt. Das grundlegende, sich wiederholende Element des Chromatins ist das Nukleosom. In diesem ist die DNA um ein Oktamer von Histon-Proteinen gewunden. Die Nukleosomen wiederum sind durch Teile von Linker-DNA verbunden. DNA und Histone unterliegen chemischen Modifikationen, die mit bestimmten Chromatin-Zuständen assoziiert sind. Einige Faktoren, die diese Modifikationen erzeugen bzw. erkennen sind in den vergangenen Jahren beschrieben worden. Heterochromatin ist eine Chromatin Form, die durch Kompaktierung, transkriptionelle Inaktivität und späte Replikation in der S-Phase gekennzeichnet ist. Es ist mit Methylierung von DNA und Histonen assoziiert. Ein Kennzeichen von Heterochromatin ist die Trimethylierung von Histon H3 Lysin 9 (H3K9me3). Sie wird durch die Methyltransferase Suv39 erzeugt und von Heterochromatin Protein 1 (HP1) erkannt. HP1 existiert in Säugerzellen in drei Isoformen. Wie diese und andere Enzyme und Faktoren spezielle Chromatin-Zustände erzeugen und aufrechterhalten, ist noch nicht vollständig geklärt. Für ein besseres Verständnis von Heterochromatin-Faktoren, habe ich mit Hilfe von stabiler Isotopenmarkierung von Aminosäuren in Zellkultur (SILAC) in einem H3K9me3 Pull-down-Experiment neue Interaktionspartner identifiziert. Activity dependant Neuroprotector (ADNP) war einer der Faktoren, die zuvor noch nicht im Kontext von Heterochromatin beschrieben wurden. Die Assoziation von ADNP mit H3K9me3 wurde in unabhängigen Experimenten bestätigt und der Faktor wurde näher charakterisiert. Zellbasierte und in vitro-Assays zeigten, dass ADNP nicht direkt an H3K9me3 bindet, sondern durch HP1 zu dieser Modifikation rekrutiert wird. Diese Assoziation von ADNP mit H3K9me3 konnte von allen drei Isoformen von HP1 vermittelt werden. Die Kartierung der Interaktions-Schnittstelle ergab, dass eine Bindung der HP1 chromoshadow Domäne an ein PxVxL Motiv innerhalb der ADNP Homöodomäne wesentlich an der Rekrutierung beteiligt ist. Die Mutation des PxVxL Motivs verursachte eine teilweise Delokalisierung vom Heterochromatin. Eine weitere Mutation eines ARKS Motivs, welches ebenfalls in der ADNP Homöodomäne vorhanden ist, verstärkte diesen Effekt. Es konnte jedoch nicht nachgewiesen werden, dass eine mögliche Lysinmethylierung in diesem Motiv an der HP1 Bindung beteiligt ist. Zur Untersuchung der Funktion von ADNP nutzte ich Knock-down in Zellen durch siRNA. Ich analysierte, ob ADNP typische Merkmale von Heterochromatin, wie die Verteilung von Histon-Modifikationen, die Lokalisierung von HP1 sowie die DNA-Methylierung, bestimmt. Ein Einfluss von ADNP auf diese Eigenschaften konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. In Luciferase-Reporter-Assays zeigte ADNP transkriptionelles Silencing Potenzial. Knock-down und Überexpressions-Experimente ergaben, dass ADNP spezifisch am Silencing von Major Satellite Repeats im perizentromerischen Heterochromatin beteiligt ist. Um herauszufinden, über welchen Mechanismus ADNP diese transkriptionelle Repression ausübt, sind weitere Studien erforderlich. Zusammenfassend identifizierte ich in dieser Arbeit ADNP als eine neue Komponente von perizentromerischem Heterochromatin, die von HP1 rekrutiert wird und an der Repression der Major Satellite Repeats beteiligt ist. Diese Studie hat zu einem tieferen Verständnis des Zusammenspiels von Suv39/H3K9me3/HP1 und dessen Auswirkungen auf die Chromatin-Funktion beigetragen.In eukaryotic cells genetic information in the form of long linear DNA fibers is stored in the cell nucleus. Time and tissue specific gene expression patterns are manifested by the combination of DNA with proteins resulting in a structure called chromatin. The basic repeating element of chromatin is the nucleosome, where DNA is wrapped around an octamer of histone proteins, interconnected by sections of linker DNA. Both DNA and histones are subject to chemical modifications, which are associated with certain chromatin states. Several factors that set or recognize such modifications have been described in the recent years. Heterochromatin is a chromatin form that is characterized by compaction, transcriptional inactivity and late replication in S-phase. It is associated with methylation of DNA and histones. Trimethylation of histone H3 lysine 9 (H3K9me3) is one hallmark of heterochromatin, and is mediated by the methyltransferase Suv39 and recognized by heterochromatin protein 1 (HP1), which has three isoforms in mammalian cells. How these and other enzymes and factors establish and maintain distinct chromatin states is not yet completely understood. For a better understanding of factors involved with heterochromatin I used stable isotope labeling by aminoacids in cell culture (SILAC) in a H3K9me3 pull-down experiment to identify new interaction partners. Activity dependent neuroprotector (ADNP) was one such factor that had not been described in a heterochromatin context before. Association of ADNP with H3K9me3 was verified with independent experiments and the factor was further characterized. Cell based and in vitro assays suggested that ADNP does not bind to H3K9me3 directly but is targeted to this modification by HP1. This recruitment of ADNP to H3K9me3 could be mediated by all three isoforms of HP1. Mapping of the interaction interface revealed a major contribution of the HP1 chromoshadow domain binding to a PxVxL motif within the ADNP homeodomain. Mutation of the PxVxL motif caused partial delocalization from heterochromatin. An additional mutation of an ARKS motif, which is also present in the ADNP homeodomain, enhanced this effect. However, involvment of a possible lysine methylation in that motif in HP1 binding was not detected. To determine the function of ADNP I used knock-down in cells by siRNA. I analyzed whether ADNP influences typical heterochromatin features such as distribution of histone modifications as well as HP1 localization as well as DNA methylation state. However, no effect on these properties could be detected. In luciferase reporter assays ADNP displayed transcriptional silencing potential. Knock-down and overexpression experiments suggested, that ADNP is specifically involved in silencing of major satellite repeats in pericentromeric heterochromatin. Further studies are needed to address by which mechanism ADNP exerts this silencing function. Altogether, in this work I identified ADNP as a novel component of pericentromeric heterochromatin, which is recruited by HP1 and acts in silencing of major satellite repeats. This study deepens the understanding of how the Suv39/H3K9me3/HP1 pathway impacts chromatin function