Crystal structure analysis on the tyrosine-regulated 3-Deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase from Saccharomyces cerevisiae

Im Gegensatz zu Säugetieren sind Prokaryonten, Hefen, Algen und Pflanzen in der Lage, die aromatischen Aminosäuren Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan zu synthetisieren. Ihre Synthese verläuft zunächst einheitlich über den Shikimatweg. Der erste gemeinsame Syntheseschritt, die Kondensation von Erythrose-4-Phosphat (E4P) und Phosphoenolpyruvat (PEP) zu 3-Deoxy-arabino-Heptulosonat-7-Phosphat (DAHP) wird in den verschiedenen Organismen durch die Familie der DAHP Synthasen katalysiert. Alle Isoenzyme benötigen ein zweiwertiges Metallion als Cofaktor und werden spezifisch durch negative Rückkopplung der unterschiedlichen Endprodukte des Syntheseweges reguliert.Die vorliegende Dissertation umfasst röntgenstrukturanalytische Untersuchungen an der tyrosin-regulierten DAHP Synthase aus Saccharomyces cerevisiae. Anhand der Doppelkomplex-Struktur der DAHP Synthase mit Mangan(II), PEP und dem E4P-Analogon Glycerol-3-Phosphat (G3P) wurden die Bindungstaschen der zwei Substrate innerhalb des aktiven Zentrums bestimmt. Vergleiche zwischen unterschiedlichen Metallion-Komplexen, Komplexen mit und ohne PEP und dem PEP-Analogon P2G erlauben Rückschlüsse auf die Rolle des Metallions und des ersten Substrates PEP für den Katalysemechanismus sowie bezüglich des stereospezifischen Reaktionsmechanismus. Die Effektor-Bindungstasche konnte anhand eines Komplexes der DAHP Synthase mit Tyrosin charakterisiert werden. Durch einen Vergleich der aktiven mit der inhibierten Struktur kann der Inhibierungsmechanismus von der Effektor-Bindungstasche zum aktiven Zentrum nachvollzogen werden. Ein Vergleich mit der Struktur der Mutante Gly226Ser komplexiert mit Phenylalanin macht die Regulationsänderung von tyrosin- auf phenylalaninreguliert durch Austausch von nur einer Aminosäure verständlich.The ability to synthesize the aromatic amino acids tyrosine, phenylalanine and tryptophan is confined to prokaryotes, yeast, algae and plants. The first common step in biosynthesis for these amino acids follows the shikimate pathway and the initial reaction, the condensation of erythrose-4-phosphate (E4P) and phosphoenolpyruvate (PEP) is catalyzed by the enzyme family of 3-Deoxy-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthases (DAHP synthases). These isoenzymes require a divalent metal ion and most of them are feedback regulated by the respective end product.This thesis describes studies on crystal structures of the tyrosine regulated DAHP synthase from Saccharomyces cerevisiae and a variety of its complexes. The binding pockets for both substrates could be determined on the basis of the double complex of the DAHP synthase with manganese, PEP and the E4P analogue glyceraldehyde-3-phosphate (G3P). Comparisons of complexes with different metal ions, with and without PEP, with the PEP analogue P2G or the E4P analogue G3P allow to draw conclusions about the role of the metal ion and the substrate PEP for catalysis and about the stereo specific reaction mechanism. A complex of DAHP synthase, manganese(II) and tyrosine reveals the effector binding pocket of this enzyme family. By comparing the active and the inhibited structures of the enzyme the inhibition mechanism of the tyrosine sensitive DAHP synthase could be understood. The structure of the point mutant Gly226Ser was also determined and comparison with the tyrosine complex of the wild type reveals the change of its feedback inhibition from tyrosine to phenylalanine sensitivity caused by this single amino acid exchange