Evolution and Structure of Differently Regulated Isoenzymes

Der erste Schritt der aromatischen Aminosäurebiosynthese ist die Kondensation von Erythrose-4-Phosphat und Phosphoenolpyruvat zu 3-Desoxy-D-arabino-Heptulo-sonat 7-Phosphat. Diese Reaktion wird durch die DAHP Synthase (EC 4.1.2.15) katalysiert. Abhängig vom Organismus handelt es sich hierbei um ein Isoenzym-System von zwei bis drei Enzymen, die entweder unreguliert oder durch jeweils ein Endprodukt, Phenylalanin, Tyrosin oder Tryptophan negativ reguliert werden. Die Hefe Saccharomyces cerevisiae besitzt zwei DAHP Synthasen, die durch Tyrosin oder Phenylalanin inhibierbar sind. Im Gegensatz dazu besitzt E. coli neben diesen beiden Regulationsarten noch ein drittes Isoenzym, welches Tryptophan-regulierbar ist. Dieses E. coli Enzym kann stabil heterolog in Hefe exprimiert werden. Das Genprodukt kann einen Hefestamm retten, der bei Inhibierung der eigenen DAHP Synthasen durch Tyrosin und Phenylalanin die allgemeine Kontrolle der aromatischen Biosynthese nicht mehr einschalten kann (Dgcn4). Zufallsmutagenesen und zielgerichtete Mutagense haben gezeigt, dass bei der Regulation der Tryptophan-inhibierbaren DAHP Synthase Aminosäurereste eine Rolle spielen, die bei den anderen beiden DAHP Synthasen nicht an der Inhibierung beteiligt sind. Im filamentös wachsenden Pilz Aspergillus nidulans wurden zwei DAHP Synthasen identifiziert und charakterisiert. Die beiden neuen Isoenzyme werden durch Tyrosin oder Phenylalanin inhibiert und tragen ein zweiwertiges Metallatom als Kofaktor. Beide Enzyme lassen sich im Gegensatz zu den bisher bekannten DAHP Synthasen nicht vollständig durch EDTA inhibieren. Zwischen beiden Isoenzymen besteht ein Feinregulierungssystem, die es dem Pilz ermöglicht den Kohlenstofffluss in den Shikimat-Weg exakt zu kontrollieren. Um die Funktionsweise der DAHP Synthase genauer verstehen zu können, wurde die Proteinstruktur der Tyrosin-inhibierbaren DAHP Synthase aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae bestimmt. Hierbei handelt es sich um einen TIM barrel Fold mit einigen zusätzlichen Bestandteilen. Durch verschiedene Mutgenese-Techniken wurde festgestellt, dass diese zusätzlichen Teile der Struktur wesentlich an der Regulierung des Enzyms beteiligt sind. Um die Regulation zwischen Tyrosin und Phenylalanin auszutauschen bedarf es den Austausch einer einzigen Aminosäure, Glycin 226 (Serin im entsprechenden Isoenzym).The first step of the biosynthesis of the aromatic amino acids is the condensation of erythrose-4-phosphate and phosphoenolpyruvate to 3-deoxy-D-arabino-heptuloso-nate 7-phosphate. This reaction is catalyzed by the DAHP synthase (EC 4.1.2.15). There is an isoenzymatic system with two or three enzymes, dependant on the organism, which are either unregulated or inhibited by the end products phenylalanine, tyrosine or tryptophan. The yeast Saccharomyces cerevisiae carries two DAHP synthases, which are inhibitable by phenylalanine or tyrosine. Beside these two regulatory mechanisms E. coli carries a third isoenzyme which is inhibitable by tryptophan. The heterologous expression of this E. coli enzyme in yeast is stable. The gene product is able to rescue a Dgcn4 yeast strain which is not able to activate its general control when inhibited by high amounts of tyrosine and phenylalanine. Random mutagenesis as well as site directed mutagenesis experiments showed that residues are involved in the regulation of the tryptophan-inhibitable DAHP synthase which are not important for regulation of the two other isoenzymes from E. coli. In the filamentous growing fungus Aspergillus nidulans two DAHP synthases were identified and characterized. The two new isoenzymes are inhibitable by phenylalanine or tyrosine and carry a bivalent metal ion as cofactor. In contrast to the all known DAHP synthases both A. nidulans isoenzymes are not completely inhibitable by EDTA. Between these two DAHP synthases there a fine-tuning in regulation exists, which enables the fungus to control the carbon-flux into the shikimate pathway in a very sensitive way. To understand the function of the DAHP synthase in a more detailed way the protein structure of the tyrosine-inhibitable isoenzyme of the yeast Saccharomyces cerevisiae was solved. It was found to be a TIM barrel fold with some extra parts. Various mutagenesis experiments revealed that these extra parts are crucial for the regulation of this isoenzyme. To exchange the regulation properties of both yeast isoenzymes it needs only one amino acid, glycine 226 (serine in the respectively isoenzyme)