Interrelations between Dry Eye Syndrome and Tear Fluid Phospholipid Transfer Protein

The simplified model of human tear fluid (TF) is a three-layered structure composed of a homogenous gel-like layer of hydrated mucins, an aqueous phase, and a lipid-rich outermost layer found in the tear-air interface. It is assumed that amphiphilic phospholipids are found adjacent to the aqueous-mucin layer and externally to this a layer composed of non-polar lipids face the tear-air interface. The lipid layer prevents evaporation of the TF and protects the eye, but excess accumulation of lipids may lead to drying of the corneal epithelium. Thus the lipid layer must be controlled and maintained by some molecular mechanisms. In the circulation, phospholipid transfer protein (PLTP) and cholesteryl ester transfer protein (CETP) mediate lipid transfers. The aim of this thesis was to investigate the presence and molecular mechanisms of lipid transfer proteins in human TF. The purpose was also to study the role of these proteins in the development of dry eye syndrome (DES). The presence of TF PLTP and CETP was studied by western blotting and mass spectrometry. The concentration of these proteins was determined by ELISA. The activities of the enzymes were determined by specific lipid transfer assays. To study the molecular mechanisms involved in PLTP mediated lipid transfer Langmuir monolayers and asymmetrical flow field-flow fractionation (AsFlFFF) was used. Ocular tissue samples were stained with monoclonal antibodies against PLTP to study the secretion route of PLTP. Heparin-Sepharose affinity chromatography was used for PLTP pull-down experiments and co-eluted proteins were identified with MALDI-TOF mass spectrometry or Western blot analysis. To study whether PLTP plays any functional role in TF PLTP-deficient mice were examined. The activity of PLTP was also studied in dry eye patients. PLTP is a component of normal human TF, whereas CETP is not. TF PLTP concentration was about 2-fold higher than that in human plasma. Inactivation of PLTP by heat treatment or immunoinhibition abolished the phospholipid transfer activity in tear fluid. PLTP was found to be secreted from lacrimal glands. PLTP seems to be surface active and is capable of accepting lipid molecules without the presence of lipid-protein complexes. The active movement of radioactively labeled lipids and high activity form of PLTP to acceptor particles suggested a shuttle model of PLTP-mediated lipid transfer. In this model, PLTP physically transports lipids between the donor and acceptor. Protein-protein interaction assays revealed ocular mucins as PLTP interaction partners in TF. In mice with a full deficiency of functional PLTP enhanced corneal epithelial damage, increased corneal permeability to carboxyfluorescein, and decreased corneal epithelial occludin expression was demonstrated. Increased tear fluid PLTP activity was observed among human DES patients. These results together suggest a scavenger property of TF PLTP: if the corneal epithelium is contaminated by hydrophobic material, PLTP could remove them and transport them to the superficial layer of the TF or, alternatively, transport them through the naso-lacrimal duct. Thus, PLTP might play an integral role in tear lipid trafficking and in the protection of the corneal epithelium. The increased PLTP activity in human DES patients suggests an ocular surface protective role for this lipid transfer protein.Kuivasilmäoireyhtymä on yleisin silmäoire, josta kärsii arviolta 8-11 prosenttia väestöstä. Tyypillisiä oireita ovat silmien kutina, roskan tunne, punoitus, kirvely ja kipu. Ongelma yleistyy iän myötä. Kuivasilmäisyyden ilmentymistä lisäävät myös mm. koneellinen ilmastointi, kuiva talvi-ilma sekä näyttöpäätetyö. Pahimmillaan oireet voivat olla erittäin hankalia ja silmän pinnan kuivuminen voi johtaa hankalaan näköä uhkaavaan silmän pinnan vaurioitumiseen. Kuivumiselta silmän pintaa suojaa 3-45 µm paksuinen kyynelnestekerros, joka muodostuu sisemmästä musiini-vesi kerroksesta sekä uloimmasta lipidikerroksesta, joka estää kyynelnesteen haihtumista. Luomirauhaset tuottavat jatkuvasti silmän pinnalle lisää rasva-aineita eli lipidejä. Lipidien liiallinen kertyminen voi estää kyynelnesteen normaalia toimintaa ja silmän pinnan kostutusta, joten on ilmeistä että kyyneleen lipidien siirtoon tarvitaan aktiivista mekanismia. Fosfolipideja siirtävä proteiini, PLTP (phospholipid transfer protein), on ensimmäiseksi tunnistettu plasmasta, jossa se yhdessä CETP:n (cholesteryl ester transfer protein) kanssa vastaa valtaosasta lipidien siirrosta lipoproteiinien välillä. PLTP:n tarkka lipidiensiirtomekanismi ei ole ollut tiedossa, eikä sen esiintymistä tai toimintaa kyynelnesteessä ole aiemmin tutkittu. Tässä väitöskirjatutkimuksessa on osoittettu että ihmisen kyynelnesteessä esiintyy korkean aktiivisuuden (HA) PLTP:tä. Histologisin menetelmin osoitettiin että kyynelnesteen PLTP erittyy kyynelrauhasesta. Langmuir mallikalvoilla saatujen tulosten perusteella PLTP pystyy toimimaan lipidimolekyylien siirtäjänä myös ilma-neste rajapinnassa. Radioaktiiviseen leimaukseen ja virtauskenttäerotteluun (field-flow fractionation) perustuvilla menetelmillä on tarkennettu PLTP:n lipidien siirtomekanismia. Saatujen tulosten perusteella PLTP:n lipidin siirtomekanismi tapahtuu aktiivisena siirtona lipoproteiinien välillä. Poistogeenisillä hiirillä (PLTP knockout) saatujen tulosten perusteella PLTP:n puuttuminen kyynelnesteestä johtaa kuivasilmäisyyden kehittymiseen. Lisäksi todettiin että kuivasilmäisillä henkilöillä kyyneleen PLTP aktiivisuus on noussut. Näiden tulosten perusteella on syytä olettaa että PLTP:lla on aktiivinen rooli kyynelnesteen rasva-aineen vaihdunnassa ja edelleen kuivasilmäoireyhtymän synnyssä