THE ROLE OF HOMEODOMAIN ONLY PROTEIN X, HOPX, IN EPIDERMAL HOMEOSTASIS AND 5-HYDROXYMETHYLCYTOSINE IS AN EPIGENETIC HALLMARK OF MELANOMA

The skin présents the first line of defence against external aggressive environmental factors. Multiple signaling pathways, spécifié transcription factors, and epigenetic mechanisms control epidermal homeostasis, and their dysregulation often leads to skin disorders and cancer. Squamous cell carcinomas (SCC) arise from sun-exposed régions of the skin and are characterized by complex pathogenesis. In order to understand the molecular mechanisms underlying squamous skin carcinogenesis, HOPX was chosen for several reasons, including: its atypical structure; its well established rôle as a marker of terminal differentiation in keratinocytes; its dual functional activity, as a tumour suppressor or an oncogene, during cancer development; and absence of knowledges about its rôle in skin carcinogenesis. HOPX is a member of the homeodomain-containing superfamily of proteins, holding an atypical homeodomain unable to bind DNA. HOPX has five alternatively spliced transcript variants, producing three isoforms (A, B and C). In the first part of my thesis work, we determined and characterized two //OPX promoter régions, named Promoter 1 and Promoter 2. We established that methylation is responsible for their various activity in normal keratinocytes and SCC cells, leading to diverse expression of i/OPXtranscripts, which play différent rôles in keratinocytes and SCC cells. Knockdown of HOPX in SCC decreased the proliferative and invasive activity of tumoral cells through accélération of apoptosis both in vitro and in vivo. On the other hand, overexpression of HOPX in SCC was able to restore tumour aggressiveness. Thus, our data demonstrate that HOPX possesses oncogenic functions during SCC progression via the activity of alternative HOPX Promoter 2. The second part of my thesis work involved analysis of 5-hmC expression levels in proliferative nodules versus malignant melanoma, both arising within giant congénital nevi (GCN). GCN have an increasing risk of melanoma transformation during childhood. They are characterized by the development of secondary melanocytic proliférations that constitute an important diagnostic challenge. Benign proliferative nodules (PNs) arising in GCN ofïten imitate atypical and suspicious clinical and histological features of melanoma. Moreover, the poorly studied genomic landscape of melanoma in young âge populations and lack of established markers complicate the correct diagnosis and lead to overestimation of the risk and over-diagnosis of melanoma. On the other hand, the early diagnosis of melanoma improves overall survival. DNA methylation is a well-established epigenetic modification, whose altérations appear in earliest stages and increase during melanoma progression. The Ten-eleven translocation (TET) enzymes catalyze the oxidation of 5-methylcytosine to 5- hydroxymethylcytosine (5-hmC), which recently has been reported as an epigenetic hallmark, associated with tumour aggressiveness and poor prognosis in a wide variety of cancers, including melanoma. We observed that PNs displayed high 5-hmC expression levels compared to melanomas, characterized by complété loss of this marker. We showed that loss of 5-hmC in melanomas was associated with downregulation of isocitrate dehydrogenases -1 and -2 and TET-enzymes. Simultaneously, these enzymes were upregulated in proliferative nodules, leading to strong 5-hmC expression. Taken together our results demonstrated that loss of 5- hmC is an important marker to discriminate benign proliferative nodules from melanomas, arising within giant congénital nevi, and to establish the correct diagnosis in ambiguous cases when histological and immunohistochemical characteristics are not spécifié enough. -- La peau représente la première ligne de la défense contre les facteurs agressifs de l'environnement. L'homéostasie épidermique adéquate nécessite la participation coordonnée de plusieurs voies de signalisation, multiples facteurs de transcription et des mécanismes épigénétiques, dont l'activation atypique provoque souvent les maladies de la peau et le cancer. Les carcinomes spinocellulaires (CSC) sont liés à des expositions répétées aux rayons ultraviolets pendant de longues années. Afin de comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la pathogenèse du CSC, la protéine HOPX a été choisi pour plusieurs raisons, notamment: sa structure atypique; son rôle bien établi en tant que le marqueur de la différenciation terminale des kératinocytes; sa double activité fonctionnelle, en tant que le suppresseur de tumeur ou l'oncogène; et l'absence de connaissances sur son rôle dans la carcinogenèse de la peau. HOPX est un membre de la superfamille des protéines contenant le domaine appelé «homeobox». Il contient un homéodomaine atypique, incapable de se lier à l'ADN. HOPX a cinq variantes de l'ARNm alternativement épissés, produisant trois protéines appelées les isoformes A, B et C. Le premier objectif de mon travail de thèse a été d'étudier le rôle de la protéine HOPX dans la pathogénèse du CSC et de comprendre comment HOPX est impliqué dans la régulation de ces voies de signalisation. Nous avons déterminé et caractérisé deux promoteurs alternatifs, nommés le HOPX Promoteur 1 et le HOPX Promoteur 2. Nous avons établi que la méthylation provoque leurs activités différentes observées dans les kératinocytes normaux et les CSC, conduisant à une expression variée des transcrits alternatifs. Pour étudier la fonction de HOPX, nous avons inhibé son expression dans le CSC à l'aide de vecteurs lentiviraux, ce qui a diminué l'activité proliférative et invasive des cellules tumorales et a accéléré l'apoptose à la fois in vitro et in vivo. D'autre part, la surexpression de HOPX dans le CSC a permis de restaurer l'agressivité tumorale. Ainsi, nos données démontrent que HOPX fonctionne comme un oncogène pendant la progression du CSC due à l'activité du HOPX Promoteur 2. La deuxième partie de ma thèse présente l'analyse de l'expression de la 5-hmC dans les nodules de prolifération par rapport au mélanome, tous les deux associés au naevus congénital géant (NCG). Le NCG est caractérisé par le risque élevé de la transformation en mélanome pendant l'enfance. Sa survenue et son potentiel évolutif sont très hétérogènes et imprévisibles. Les proliférations mélanocytaires secondaires se développent souvent sur la surface du NCG et constituent un problème diagnostique majeur. Les nodules de prolifération (NPs) peuvent imiter les caractéristiques atypiques et suspectes du mélanome. En outre, les altérations génétiques du mélanome, qui sont peu étudiées chez les jeunes, et l'absence de marqueurs efficaces et significatifs compliquent l'établissement d'un diagnostic correct et entraînent la surestimation du risque et le surdiagnostic du mélanome. D'autre part, un diagnostic précoce du mélanome améliore la survie globale. La méthylation de l'ADN est l'une des modifications épigénétiques bien étudiées, dont les altérations sont observées en premiers stades et augmentent pendant la progression du mélanome. Les TET-enzymes catalysent l'oxydation de la 5-méthylcytosine en 5-hydroxyméthylcytosine (5-hmC), qui a été récemment signalée comme un markeur épigénétique associé à l'agressivité tumorale et au mauvais pronostic dans une grande variété des cancers, y compris le mélanome. Par une approche histologique, mon travail a démontré que les NPs exposent les niveaux élevés de la 5-hmC par rapport aux mélanomes, caractérisés par une perte complète de ce marqueur. Nous avons dénoté que le déficit de 5-hmC dans les mélanomes était associé à l'inhibition des isocitrate déshydrogénases -1 et -2 et des enzymes- TET. Nous avons par la suite observé que ces enzymes ont été hautement exprimés dans les NPs, ce qui a conduit à une forte expression de la 5-hmC. Par ces résultats, mon deuxième projet a permis de confirmer que la perte de 5-hmC est un marqueur important pour discriminer les NPs bénins des mélanomes apparus sur le NCG afin d'établir un diagnostic correct