Stem cell chimerism in the germ cell lineage? : a polymorphic marker study

Primordial germ cells are the embryonic precursor cells of sperm and ova. They are concluded to differentiate outside the gonadal area probably in the extraembryonic mesoderm. Their invasive migration through the stromal tissues of the dorsal mesentery adherent to the extracellular matrix is a well accepted fact in mice. The aim of this study was to set up a technique based on the use of individual-specific markers to test the hypothesis on the migration of primordial germ cells in a large animal model. The hypothesis, supported by feeble proof until now, states that there would be substantial chimerism in the progeny of primordial germ cells in bovine twins originating from transmission of the cells through placental vascular anastomoses during fetal life. Our aim was pursued by microsatellite analysis of the highly polymorphic bovine MHC locus DRB3. Polymerase chain reaction and capillary electrophoresis were optimized using 21 non-chimeric animals, ten cows and eleven bulls. The DRB3 microsatellite of one bull was cloned to isolate single alleles. Whole blood-derived DNA from 11 chimeric animals, the leukocyte chimerims of which had earlier been quantified by in situ hybridisation, and 47 semen-derived DNA samples from twin borne AI bulls were analysed in the last phase of this study. Primordial germ cell chimerism did not seem to occur in a substantial quantity in twin borne bovine bulls. Extension of the analysis described here to other polymorphic repeat loci should clarify the cases were traces of possible chimerism was found by analysing the above locus.Primordiala groddceller är de embryonala föregångarna till spermier och ägg. Man har enats om att de utvecklas utanför den gonadala regionen och man tror att de differentierar sig i det extraembryonala mesodermet. Deras invasiva migration, fastbundna till det extracellulära matrixet genom det dorsala mesenteriets stromala vävnad, har blivit godkänd som fakta i en musmodell. Syftet med denna undersökning var att hitta en teknik som baserar sig på individ specifika markörer för att testa en hypotes angående de embryonala groddcellernas vandring i en stordjursmodell. Hypotesen, som fram till nu har stöttats med bara föga bevis, konstaterar att det skulle finnas substantiell chimärism bland descendenter från de primordiala groddcellerna i nötdjurstvillingar. Dessa härstammar från cellernas transmission genom vaskulära anastomoser i placenta under fostertiden. Vi analyserade ett synnerligen polymorfiskt mikrosatellitlocus, DRB3, för att se mängden av olika genotyper i spermaprov. Optimeringen av metoden som baserar sig på PCR och kapillär elektrofores utfördes med 21 icke-chimära djur; tio kor och elva tjurar. DRB3 mikrosatelliten från en tjur var klonad för att isolera enskilda allel. Till sist analyserades sperman av 47 tjurar som är födda som tvillingar. Helblod av 11 djur som tidigare hade verifierats vara leukocytchimära med in situ hybridisation analyserades också. Man kunde visa att de embryonala groddcellernas chimärism, förmodligen inte sker som ett substantiellt fenomen hos nötdjurstvillingar. En spridning av den nu använda metoden till andra polymorfiska repetition sekvens loci förklarar de tvivelaktiga fallen som hittades vid analysering av DRB3 locus.Primordiaaliset ituradan solut, niin sanotut PGC solut, ovat siittiöiden ja munasolujen sikiönkehityksen aikaisia edeltäjäsoluja. PGC solujen on päätelty erilaistuvan gonadialueen ulkopuolella, luultavasti sikiön ulkopuolella sijaitsevassa mesodermissä. Hiirellä näiden solujen invasiivinen vaellus suoliliepeen strooman läpi, soluväliaineeseen liittyneenä, on laajalti hyväksytty malli. Tämän tutkimuksen tavoite oli pystyttää yksilöspesifisiin markkereihin perustuva tekniikka, jolla kyettäisiin testaamaan hypoteesia PGC solujen vaelluksesta suureläin mallissa. Hypoteesin mukaan nauta kaksosilla esiintyisi pysyvää ituratakimerismiä PGC solujen siirtyessä sikiöstä toiseen istukan verisuonianastomoosien kautta. Tavoitteeseen pyrittiin analysoimalla erittäin polymorfista naudan MHC-kompleksin lokusta; DRB3 geenin mikrosatelliittia. Polymeraasiketjureaktion ja kapillaari geelielektroforeesin optimointiin käytettiin 21:stä ei-kimeeristä eläintä; kymmentä lehmää ja yhtätoista sonnia. Yhden sonnin DRB3 mikrosatelliitti kloonattiin yksittäisten alleelien eristämiseksi. 11:sta, aikaisemmin in situ tekniikalla leukosyyttikimeeriseksi varmistetun, eläimen kokoverestä eristetyt DNA-näytteet ja 47:n keinosiemennykseen käytetyn, kaksosena syntyneen sonnin spermasta eristetyt DNA näytteet analysoitiin DRB3 mikrosatelliittialleelien lukumäärän suhteen. PGC solu kimerismi osoittautui esiintyessään enintään marginaaliseksi ilmiöksi kaksoissonneilla. 47:n sonnin spermanäytteistä ainoastaan yhdestä löydettiin mahdollisia viitteitä neljästä DRB3 alleelista ja siten kimerismistä. Jatkotutkimuksissa pyritään täydentämään tekniikkaa käyttämällä useampia polymorfisia mikrosatelliittilokuksia analyysissä, jolloin suuremmalla todennäköisyydellä havaitaan normaaliin homo- tai heterotsygoottitilanteeseen nähden kasvanut alleelimäärä kimerismin esiintyessä