Chromosome dynamics in Bacillus subtilis -Characterization of the Structural Maintenance of Chromosomes (SMC) complex

Alle Zellen müssen ihr Erbmaterial verdoppeln und dafür Sorge tragen, daß jede Tochterzelle einen kompletten Satz des Erbguts vor der Zellteilung erhält. In Bakterien müssen die Chromosomen organisiert und kompaktiert werden, während sie gleichzeitig dynamisch sein müssen, um laufende zelluläre Prozesse wie DNA Reparatur, Rekombination, Transktiption und Replikation zu ermöglichen. SMC (Structural Maintenance of Chromosome) Proteine bilden eine ubiquitäre Proteinfamilie, die eine zentrale Rolle in verschiedenen Chromosomendynamiken spielt. Das Hauptaugenmerk in dieser Arbeit ruht auf der Charakterisierung der SMC Proteine und ihrer Partner aus Bacillus subtilis. Genbanksuchen haben zu der Identifizierung zweier Interaktionspartner des SMC Proteins geführt. Diese Proteine, ScpA und ScpB, sind in Bakterien und Archaen konserviert. Die Deletion des scpA oder des scpB Gens führte zu einem der smc Deletionsmutante ähnlichen Phänotyp, d.h. temperatursensitivem langsamen Wachstum (unterhalb 23°C), dekondensierten Nukleoiden (zelluläre Struktur der Chromosomen) und einem ausgeprägten Segregationsdefekt. Die gleichzeitige Deletion der Gene erzeugte keinen veränderten Phänotyp, was zeigt, dass alle drei Proteine im gleichen Aspekt der Chromosomen-Kondensation und Segregation fungieren. Um ihre Funktion in vivo zu untersuchen, wurden die Proteine in Zellen mit Hilfe von voll funktionellen GFP Fusionen lokalisiert. Alle drei Proteine bildeten diskrete Foci in den Zellen, einem bis dato unbekannten Lokalisationsmuster, das sich dynamisch während des Zellzyklus veränderte: zu Beginn des Zellzyklus befanden sich die Foci in der Zellmitte, und nach der Verdopplung des Focus wanderten die beiden Foci rasch entgegengesetzt in Richtung der Zellpole. In diesen bipolaren Foci verblieben die drei Proteine für den Rest des Zellzyklus. Die Bildung des Proteinkomplexes konnte durch Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET) und durch Depletionsstudien belegt werden. So konnte die Bildung der Foci nur in Anwesenheit aller Proteine beobachtet werden, nicht jedoch in Abwesenheit eines der drei Proteine. Die spezifische Lokalisierung des SMC Komplex hing auch von fortlaufender DNA Replikation ab, von zellulärer Gyrase Aktivität (d.h. von der Struktur der DNA), sowie von der ATPase-Aktivität von SMC. Die Überproduktion von SMC führte zu einer Über-Kondensation der Nukleoide, wobei die Lokalisation des SMC Komplexes erhalten blieb, was darauf hin deutet, daß die beobachteten Foci aktive Kondensationszentren darstellen. Weiterhin zeigten die Proteine des SMC Komplex wachstumsabhängige Expression. SMC und ScpB waren nur in wachsenden Zellen vorhanden, und wurden rasch beim Übergang in die Statonärphase abgebaut. Die Analyse der RNA Mengen in verschiedenen Wachstumsphasen durch Primer Extensionsanalyse zeigte, daß das smc Transkript im Übergang zur Stationärphase nicht abnimmt. Diese Experimente zeigten einen bisher nicht identifizierten smc Promotor auf, und erbrachten den Nachweis, daß SMC posttranskriptionell reguliert wird. Die smc, scpA, und scpB Deletionsmutanten wiesen ebenfalls eine ausgeprägte Sensitivität gegenüber Mitomycin C (MMC) auf, welches Doppelstrangbrüche (DSBs) in die DNA einführt. Demnach wird der SMC Komplex ebenfalls für die Reparatur von DSBs benötigt. Weiterhin wurde die Funktion des SMC Proteins YirY untersucht, welches homolog zum DNA Reparatur Protein SbcC aus Escherichia coli ist. Die yirY Deletion führte ebenfalls zu einer deutlichen Sensitivität zu MMC, was eine Rolle in der DSB Reparatur belegt. In MMC behandelten Zellen bildete YirY Foci auf der DNA, welche aktive DSB Reparaturzentren darstellen könnten. In Gegensatz dazu waren die anderen Proteine aus dem gleichen Operon, AddA, AddB, and SbcD überall in den Zellen vorhanden und bildeten keine speziellen Strukturen, was darauf hindeutet, daß SbcC und AddAB in verschiedenen Reparaturwegen fungieren. Die subzelluläre Lokalisation der Topoisomerase IV Untereinheiten ParC und ParE wurde ebenfalls in dieser Arbeit beleuchtet. ParC lokalisierte auf dem gesamten Nukleoid, ganz im Gegenteil zu einer früheren Studie, in der ParC ausschließlich in der Nähe der Zellpole vorhanden war, wonach ParC eine spezialisierte Rolle bei der Dekatenierung von Chromosomen zugesprochen wurde. Durch Überproduktion von ParC und ParE wurden die Nukeloide noch stärker kompaktiert, was zusammen mit der Lokalisierung eine generelle Rolle in der Chromosomenkompaktierung belegt. Insgesamt läßt sich schlußfolgern, daß die Lokalisation von Proteinen, die an der Chromosomensegregation, DNA Reparatur und Translation beteiligt sind, ein wesendlich definierteres Bild der räumlichen Funktion der Proteine in lebenden Bakterien erbrachte