Structural studies of the budding yeast kinetochore using single molecule localization microscopy

Proper chromosome segregation is crucial for cell division. During metaphase, chromosomes are lined up in the metaphase plane and subsequently, in anaphase, the sister chromatids are pulled apart toward the opposite spindle poles. Errors during segregation lead to, for example, aneuploidy, where daughter cells receive an aberrant number of chromosomes. Each chromatid is captured by spindle microtubules and this interaction is mediated by a structure called the kinetochore. The general architecture of the kinetochore is preserved in eukaryotes. A simple model to study its properties is Saccharomyces cerevisiae, where a single copy of the kinetochore is attached to one microtubule, whereas in higher organisms kinetochores have multiple attachment sites. It is assumed that single kinetochores in other fungi and multicellular organisms are composed of multiple copies of units analogous to the budding yeast kinetochore. The kinetochore takes part in several processes during mitosis including maintaining proper attachment of a chromosome to the spindle and mediation of forces to move chromosomes. These functions are strongly dependent on the kinetochore's structure and its potential remodelling over the cell cycle. The molecular composition of the budding yeast kinetochore has already been precisely described. On the other hand, its structural organization in a context of cellular environment and other kinetochore components must be further explored. Most of the information regarding the intact kinetochore structure comes from electron microscopy-based (EM) studies and fluorescence microscopy. Due to the small size of the budding yeast kinetochore, its general architecture has been visualized with EM in situ only recently. However, the images in this study lack structural details and the identity of most of the kinetochore components has not been established. Conversely, conventional fluorescence microscopy has provided some information about the localization of several kinetochore components along the spindle axis. Yet, a few bottlenecks in this approach are present. By virtue of light diffraction, the resolution of common light microscopy is restricted to approximately 250 nm. Therefore, this approach is too limited to detect exact intrakinetochore distributions of kinetochore subunits. Moreover, single kinetochores are not observable in yeast, since the fluorescence signal coming from a cluster of labelled yeast kinetochores is seen as one spot. Additionally, fine structural details cannot be observed by using light microscopy. The main technical strategy to overcome the aforementioned issues is localization microscopy. This technique combines several advantages of fluorescence and electron microscopy - localization with high precision (down to tens of nanometers) and the possibility to provide some structural insights of an observed particle in its natural environment. Obtaining images beyond the diffraction limit relies on the activation of only a small fraction of fluorophores in the sample at the same time. Thus, a non-overlapping signal from each fluorophore can be localized with an unprecedented precision. Repeated cycles of activation, localization and deactivation allow for the reconstruction of a high-resolution image. The main aim of my study was to visualize the individual kinetochores in budding yeast using single-molecule localization microscopy. Subsequently, I used dual-color single-molecule localization microscopy to reconcile the conflicting data coming from the reconstitution- and fluorescence microscopy-based approaches about the localization of the majority of the kinetochore components in metaphase. Subsequently, I established the counting reference assay that allows to estimate the protein copy number of a protein of interest in budding yeast. Finally, I have used the method to calculate the absolute protein copy number of the major kinetochore subunits in metaphase and, partially, in anaphase. The single-color imaging recapitulated the Rabl-like distribution of the kinetochores in interphase. The metaphase kinetochores were randomly distributed within the clusters. In anaphase, I have observed a significant reduction of distances between the kinetochores. With dual-color imaging I have positioned Cnn1 and Mif2 proteins more than 20 nm from the C-terminus of Spc105. The COMA components, Ctf19 and Okp1 have been localized between the centromeric site (defined by Cnn1, and Mif2) and the outer kinetochore - around 14,5 nm away from Spc105. The previous microscopy-based study positioned the C-termini of MTW1 ~9 nm away from each other, which contradicts results obtained by crystallising the complex where each C-terminus was only few nanometers away from each other. My approach showed that the C-termini are only 3 nm away from each other. Moreover, I localized the C-termini of Spc105, MTW1 and Spc25 close to each other, which agrees with the reconstitution data. Furthermore, I showed that the C-terminus of Ndc80 is ~13,5 nm away from the C-terminus of Spc25, which indicates a slight tilt of NDC80 relative to the spindle axis. I have shown that the nuclear pore complex is a reliable counting reference to estimate the kinetochore protein copy numbers. My measurements indicate the gradual increase of the protein abundance within the kinetochore from the inner to the outer kinetochore site in metaphase. I calculated that there are 2 copies of Mif2 and Cnn1 but 5 of COMA. In the outer kinetochore there are 5 - 6 copies of Spc105, 6 - 8 of MTW1 and 10 - 12 of NDC80. This stands in contrast to the reconstitution-based view on the kinetochore protein numbers. I have analysed only a couple of the proteins in anaphase. My analysis indicates that MTW1 and NDC80 increase their protein copy numbers, which would potentially contribute to the efficiency of the complex in chromosome transportation at the end of the cell division. In my work, I have provided data on the localizations of the major kinetochore components during metaphase. Using the counting reference, I showed that the yeast centromere binds the microtubule efficiently by using the increasing protein copy numbers of the kinetochore, from 2 copies of the centromere-related proteins to ~10 of microtubule-binders. Moreover, I discovered that the outer kinetochore increases its protein copy numbers in anaphase.Die korrekte Trennung der Chromosomen ist von entscheidender Bedeutung für die Zellteilung. Während der Metaphase ordnen sich die Chromosomen in der Äquatorialebene an, in der darauffolgenden Anaphase werden die Schwesterchromatiden in Richtung der gegenüberliegenden Spindelpole auseinandergezogen. Fehler während der Trennung können beispielsweise zu Anaploidie führen, bei der die Tochterzellen eine unreguläre Anzahl an Chromosomen erhalten. Jede Chromatide wird durch einen Spindelmikrotubulus festgehalten, vermittelt durch eine Kinetochor genannte Struktur. Die grundlegende Architektur der Kinetochore ist in Eukaryoten konserviert. Ein einfaches Modell, deren Eigenschaften zu untersuchen ist Saccharomyces cerevisiae, in dem eine einfache Kopie des Kinetochors an einem Mikrotubulus hängt, während Kinetochore in höheren Organismen multiple Bindungsstellen aufweisen. Es wird vermutet, dass einzelne Kinetochore in anderen Pilzen und Multizellulären Organismen aus mehreren Kopien von Einheiten der Kinetochore von S. cerevisiae bestehen. Das Kinetochor nimmt an mehreren Prozessen während der Mitose teil, einschließlich der Aufrechterhaltung der ordnungsgemäßen Befestigung des Chromosoms zur Spindel und der Vermittlung von Kräften zur Bewegung der Chromosomen. Diese Funktionen sind streng abhängig von der Struktur des Kinetochors und seiner Remodellierung durch den Zellzyklus hindurch.Die Molekulare Zusammensetzung des S. cerevisiae Kinetochors wurde bereits präzise beschrieben. Andererseits muss die strukturelle Organisation im zellulären Kontext und andere Kinetochorbestandteile weiter untersucht werden. Die meisten Informationen bezüglich der intakten Kinetochorstruktur kommen aus elektronenmikroskopischen (EM) Untersuchungen und der Fluoreszenzmikroskopie. Aufgrund der geringen Größe des Kinetochors von S. cerevisiae konnte dessen allgemeine Architektur erst kürzlich mittels EM in situ visualisiertwerden. Allerdings fehlt es der Studie an strukturellen Details und die Identität der meisten Kinetochorkomponente wurde nicht festgestellt. Auf der anderen Seite hat die konventionelle Fluoreszenzmikroskopie einige Informationen über die Lokalisierung einiger Kinetochorkomponenten entlang der Spindelachse bereitgestellt. Dennoch gibt es noch ein paar Engpässe in diesem Ansatz. Aufgrund der Lichtbeugung ist die Auflösung der herkömmlichen Lichtmikroskopie auf 250nm beschränkt. Deshalb ist dieser Ansatz für die Detektion der exakten Verteilung der Kinetochorkomponente innerhalb desselben zu beschränkt. Weiterhin sind einzelne Kinetochore in Hefe nicht sichtbar, da das Fluoreszenzsignal des Clusters gelabelter Hefekinetochore als ein einzelner Fleck wahrgenommen wird. Zusätzlich können feinstrukturelle Details mittels Lichtmikroskopie nicht beobachtet warden. Die hauptsächliche technische Strategie, die genannten Schwierigkeiten zu überkommen ist die Lokalisationsmikroskopie. Diese Technik verbindet mehrere Vorteile von Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopie - Lokalisierung mit hoher Präzision (bis auf ca. zehn Nanometer) und die Möglichkeit, strukturelle Einsichten zu einem einzelnen beobachteten Molekülen in seiner natürlichen Umgebung zu gewinnen. Die Gewinnung von Bildern über die Brechungsgrenze hinaus beruht auf der gleichzeitigen Aktivierung nur eines kleinen Bruchteils der Fluorophoren in der Probe. Somit kann ein nicht überlappendes Signal jedes Fluorophors mit beispielloser Präzision lokalisiert werden. Wiederholende Zyklen von Aktivierung, Lokalisierung und Inaktivierung erlauben die Rekonstruktion eines hochaufgelösten Bildes. Das Hauptziel der vorliegenden Studie war es, einen Teil der S. cerevisiae Kinetochorproteine zu lokalisieruen und deren Kopienzahl mittels Lokalisationsmikroskopie zu bestimmen. Anschließend habe ich Zweifarben-Einzelmoleküllokalisationsmikroskopie verwendet, um die sich widersprechenden Daten zur Lokalisation der Mehrheit der Kinetochorkomponenten in der Metaphase aus Rekonstitutions- und Fluoreszenzmikroskopie-basierten Ansätzen miteinander in Einklang zu bringen. Ich habe den Zählreferenz-Assay etabliert, der es möglich macht, die Proteinkopienzahl eines Proteins von Interesse in S. cerevisiae abzuschätzen. Schließlich habe ich diese Methode verwendet, um die absolute Proteinkopienzahl der wichtigsten Kinetochoruntereinheiten in Metaphase und teilweise in Anaphase zu berechnen. Die Einfarben-Bildgebung rekapitulierte die Rabl-like Verteilung der Kinetochore in der Interphase. Die Metaphasenkinetochore waren zufällig innerhalb des Clusters verteilt. In der Anaphase habe ich eine signifikante Reduktion der Abstände zwischen Kinetochoren beobachtet. Mittels Zweifarben-Bildgebung habe ich Cnn1 und Mif1 über 20nm vom C-Terminus von Spc105 lokalisiert. Die COMA-Komponenten Ctf19 und Okp1 konnten zwischen der centromerischen Position (definiert durch Cnn1 und Mif1) und dem äußeren Kinetochor lokalisiert werden, ca. 14,5 nm von Spc105 entfernt. Die vorherige mikroskopiebasierte Studie hat die C-Termini von MTW1 ca. 9 nm voneinander entfernt positioniert, was den Ergebnissen widerspricht, die durch Kristallisation des Komplexes gewonnen wurden, wobei die C-Termini nur wenige Nanometer voneinander entfernt waren. Mein Ansatz hat hat gezeigt, dass die C-Termini nur 3 nm voneinander entfernt sind. Weiterhin habe ich die C-Termini von Spc105, MTW1 und Spc25 nah aneinander lokalisiert, was mit den Rekonstitutionsdaten übereinstimmt. Weiterhin habe ich gezeigt, dass der C-Terminus von Ndc80 ca 13,5 nm vom C-Terminus von Spc25 entfernt ist, was auf eine leichte Neigung von NDC80 relativ zur Spindelachse hinweist. Ich habe gezeigt, dass der Kernporenkomplex eine verlässliche Zählreferenz zur Schätzung der Kopienzahl der Kinetochorproteine ist. Meine Messungen deuten auf eine graduelle Zunahme der Proteinmenge innerhalb der Kinetochors von Innen nach Außen hin. Ich habe berechnet, dass es 2 Kopien von Mif2 und Cnn1, aber 5 von COMA gibt. Im äußeren Kinetochor gibt es 5-6 Kopien von Spc105, 6-8 von MTW1 und 10-12 von NDC80. Dies steht im Kontrast zur rekonstitutionsbasierten Sicht auf die Kinetochorproteinanzahl. Ich habe nur ein paar der Anaphasenproteine analysiert. Meine Untersuchungen deuten darauf hin, dass MTW1 und NDC80 ihre Kopienzahl erhöhen, was möglicherweise zur Effizienz des Komplexes beim Choromosomentransport am Ende des Zellzyklus beiträgt. In meiner Arbeit habe ich Daten zur Lokalisation der wichtigsten Kinetochorkomponenten während der Metaphase gewonnen. Mithilfe der Zählreferenz konnte ich zeigen, dass das Hefecentromer effizient an den Mikrotubulus bindet, indem es die zunehmende Proteinkopienzahl des Kinetochors nutzt - von 2 Kopien der Centromerzugehörigen Proteine bis zu ca. 10 Kopien der mikrotubulusbindenden Proteine. Ferner habe ich eine Zunahme der Proteinanzahl des äußeren Kinetochors in der Anaphase gefunden