Regulations of p53 pathway in anticancer therapy: p53 inhibition

Cílem této práce bylo zjistit, zda a jakým způsobem ovlivňuje inhibitor proteinu p53, pifithrin-?, u lidských nádorových buněk aktivaci biochemických cest vedoucích k detekci a reparaci mitoxantronem vyvolaného poškození DNA nebo indukci apoptózy. Jako modelový systém byla zvolena buněčná linie MOLT-4 odvozená od lidské T-lymfocytární leukémie. Zaměřili jsme se na studii viability a proliferační aktivity buněk, apoptózy a buněčného cyklu pomocí flow-cytometrických metod a na expresi sledovaných proteinů (p53 a jeho fosforylované formy, p21WAF1/CIP1, ERK 1/2, lamin B a ?-aktin) využitím elektroforézy a western blotu s následnou imunodetekcí. Zjistili jsme, že pifithrin-a snižuje u buněk MOLT-4 indukci p53 a následnou indukci p21WAF1/CIP1 0,5 nmol/l mitoxantronem pouze v časném intervalu (4 hodiny), v pozdější fázi převáží potenciace cytotoxického působení mitoxantronu a indukce apoptózy, provázená již srovnatelným vzestupem p53 i p21WAF1/CIP1. Mitoxantronem indukovaná zástava buněčného cyklu v G2/M fázi není inhibicí p53 ovlivněna.The aim of this work was to determine whether and how the protein p53 inhibitor, pifithrin-?, affects in human tumor cells biochemical pathways leading to the detection and repair of DNA damage induced by mitoxantrone and/or induction of apoptosis. As a model system cell line MOLT-4 derived from human T-lymphocytic leukemia was selected. We focused on the study of viability and proliferative activity of cells, apoptosis and cell cycle using flow-cytometric methods and we also monitored the expression of proteins (p53 and its phosphorylated forms, p21WAF1/CIP1, ERK 1/2, lamin B and ?-actin) using electrophoresis and Western blot followed by immunodetection. We have found that pifithrin-? reduced in MOLT-4 cells, induction of p53 and subsequent induction of p21WAF1/CIP1 caused by 0,5 nmol/l mitoxantrone in the early interval (4 hours), and at a later stage the potentiation of cytotoxic action of mitoxantrone and the induction of apoptosis prevailed, accompanied by the comparable increases in p53 and p21WAF1/CIP1. Mitoxantrone-induced cell cycle arrest in G2/M phase is not affected by inhibition of p53.Katedra biologických a biochemických vědDokončená práce s úspěšnou obhajobo