Regulations of p53 pathway in anticancer therapy: MAPK inhibitors

V této práci jsme se zabývali molekulárními změnami po působení mitoxantronu a inhibitoru U0126 (inhibitor MEK1/2) u lidských nádorových buněk. Cílem práce bylo zjistit, zda a jakým způsobem ovlivňuje inhibitor U0126 aktivaci biochemických cest po mitoxantronem vyvolaném poškození DNA. Jako modelový systém jsme použili buněčnou linii MOLT-4 odvozenou od lidské T-lymfocytární leukémie. Na počátku jsme sledovali proliferační aktivitu buněk po působení různých dávek mitoxantronu s cílem vybrat vhodné dávkové schéma pro další studii. Dále jsme sledovali proliferační aktivitu buněk po působení mitoxantronu a inhibitoru U0126 a hodnotili vliv tohoto inhibitoru na působení mitoxantronu. Zjistili jsme, že inhibice MEK1/2 kinázy pomocí U0126 vede po mitoxantronem vyvolaném poškození DNA ke zvýšenému odumírání buněk. Průtokovou cytometrií jsme sledovali indukci apoptózy za použití duálního značení Annexinem V a propidium jodidem a optických parametrů rozptylu světla. Indukci apoptózy jsme stanovili v reakci na různé dávky mitoxantronu, inhibitor U0126 a jejich kombinaci v různých časových intervalech působení. Bylo potvrzeno, že U0126 inhibicí MEK1/2 zastaví cestu napomáhající buněčné proliferaci a přežívání, a po poškození DNA je tak více buněk posíláno do apoptózy. Pro lepší přehled o průběhu buněčného cyklu jsme u jednotlivých skupin zanalyzovali obsah DNA v buňce. U buněk MOLT-4 mitoxantron způsobuje zástavu buněčného cyklu v G2/M fázi následovanou rozvojem apoptózy, inhibice MEK1/2 kinázy pomocí U0126 tuto zástavu buněčného cyklu nenarušuje. Následně jsme studovali změny v expresi proteinů podílejících se na regulaci buněčného cyklu a rozvoji apoptózy (p53 a jeho posttranslační modifikace, p21, ERK1/2, lamin B). Expresi proteinů jsme detekovali pomocí elektroforézy a Western blottingu s následnou imunodetekcí. Zjistili jsme, že inhibice MEK1/2 pomocí U0126 u buněk MOLT-4 nemá zásadní vliv na expresi proteinu p53, ani na expresi jeho fosforylovaných forem. Proteiny jsme kvantifikovali pomocí měření integrované optické denzity, která nám poskytla detailnější přehled o množství proteinů u jednotlivých skupin ovlivněných buněk.In the project we were focused on molecular changes activated by mitoxantrone and inhibitor U0126 (inhibitor MEK1/2) in human tumor cells. The aim of the thesis was to find if and how inhibitor U0126 is activating biochemical pathways after the DNA damage caused by mitoxantrone. As a model system we selected cell line MOLT- 4, derived from T-lymphocytic leukemia. First, we observed the dynamics of cell viability and proliferation after the effect of different doses of mitoxantrone. The object of the task was to choose suitable dose scheme for other studies. Then we observed proliferation activity of the cells after the effect of mitoxantrone and inhibitor U0126 and we evaluated the influence of inhibitor to the action of mitoxantrone. Cell line MOLT-4 after exposure of mitoxantrone and inhibition of MEK1/2 by U0126 together caused increase in dead cells. The induction of apoptosis was evaluated by flow cytometry. We used the flowcytometric methods with the application of dual mark by Annexin V and propidium iodide and optical parameters of light scattering. The induction of apoptosis was measured after the exposure of the cells to the different doses of mitoxantrone, inhibitor U0126 and their combination in the different time lags. It was proved that U0126 through the inhibition MEK1/2 stopped the pathway leading to proliferation and cell survival and after the DNA damage more cells were sent to apoptosis. For better view of the process we studied of the cell cycle, using the analysis of DNA content. In the cell line MOLT-4 mitoxantrone caused G2/M cell cycle arrest followed by apoptosis, inhibition of MEK1/2 had not any influence on the G2/M arrest. Follow-up research was concentrated on the changes in the expression of the proteins that participate in the regulation of cell cycle and progress of apoptosis (p53 and its post-translation modifications, p21, ERK1/2, lamin B). The proteins were detected by electrophoresis and Western blot followed by immunodetection. The results lead to conclusion that inhibition of MEK1/2 has not influence on the expression of p53 and its post-translation modifications in the cell line MOLT-4. Subsequently, we used the measurement of integrated optical density for the quatification of proteins. This step provided more detailed information about the amount of proteins in individual groups of affected cells.Katedra biologických a biochemických vědDokončená práce s úspěšnou obhajobo