Solution structure of the 30 kDa homodimeric sud protein from Wolinella succinogenes

Periplasmic Sud protein encoded by the Wolinella succinogenes catalyses the transfer of bound polysulfide-sulfur to the active site of the membrane bound polysulfide reductase. The homodimeric protein consists of 131 residues per monomer, each with one cysteine residue in the active site. Polysulfide-sulfur is covalently bound to the catalytic Cys residues of the Sud protein. In order to understand the structure-function relationship of this protein, the features of its solution structure determined by heteronuclear multidimensional NMR techniques are reported here. The first step of structure determination leads to resonance assignments using 15N/13C/2H- and 15N/13C-labeled protein. The sequential backbone and side chain resonance assignments have been successfully completed. Structure calculations were carried out using the ARIA program package. The structure is based on 2688 NOE-derived distance restraints, 68 backbone hydrogen bond restraints derived from 34 slow-exchanging backbone amide protons and 334 torsion angle restraints obtained from the TALOS program as well as 158 residual dipolar coupling restraints for the refinement of relative vector orientations. The three-dimensional structure of the Sud protein was determined with an averaged rootmean- square deviation of 0.72 Å and 1.28 Å for the backbone and heavy atoms, respectively, excluding the terminal residues. Without the poorly defined segment between residues 90-94 the average r.m.s.d. value drops down to 0.6 Å and 1.14 Å. The ensemble refined with residual dipolar coupling (rdc) restraints shows good convergence. The r.m.s.d. value for the backbone heavy atoms, excluding residues 90- 94, drops down from 0.97 to 0.66 for the rdc-refined ensemble. The relative orientation of the two monomers in the protein structures refined with residual dipolar coupling restraints are also different from those without residual dipolar coupling restraints. The structure determination of the dimeric protein has been hampered by the high molecular mass (30 kDa), severe peak degeneracy, and by the small number of experimental intermonomer NOEs (relative orientation problem of two monomers). For the resonance assignments of aliphatic side chain, many resonances were ambiguously assigned because of severe overlap of signals. The Sud dimer protein contains 17 Lys, 14 Leu and one His tag for each monomer. It complicated the resonance assignments. The conventional 3D 15N-separated TOCSY HSQC experiment failed because of the large molecular weight which results in line broadening and hence made the resonance assignments of side chains more difficult. The determined structure contains a five-stranded parallel ß-sheet enclosing a hydrophobic core, a two-stranded anti-parallel ß-sheet and seven a-helices. The dimer structure is stabilized predominantly by hydrophobic residues. Sud catalyses the transfer of the polysulfide-sulfur to cyanide, similar to rhodanese encoded by Azotobacter vinelandii (Bordo et al., 2000). The two proteins are similar in the active site environment primarily owing to the main-chain conformation of the active-site loop with the cysteine residue and with respect to the surrounding positively charged residues. The active-site loop (residues 89-95) in the Sud protein appears to be flexible, reflected by few assigned proton resonances of residues 90-94 in the active site. Despite their similarity in function and their similar structure in active site, the amino acid sequences and the folds of the two proteins are remarkably different. The negatively charged polysulfide interacts with positively charged R46, R67, and R94 and hence may be stabilized in structure. The mutation of one of the three arginines that are also conserved in rhodanese from A. vinelandii leads to a loss of sulfur-transfer activity. The polysulfide chain extends from inside of Sud protein to outside, where Sud may form contacts with polysulfide reductase. These contacts provide the possible polysulfide-sulfur transfer from Sud protein to the active site of polysulfide reductase.Das periplasmische Sud-Protein aus Wolinella succinogenes überträgt den gebundenen Polysulfidschwefel in das aktive Zentrum der membrangebundenen Polysulfidreduktase. Das homodimere Protein enthält 131 Aminosäurereste pro Monomer. Im aktiven Zentrum des Monomers ist eine freie Cysteingruppe angeordnet. Das Polysulfid ist kovalent an dieses katalytische Cystein des Sud- Proteins gebunden. Für das Verständnis der Struktur und Funktion dieses Proteins wurde die Lösungsstruktur mit heteronuclearer, multidimensionaler NMRSpektroskopie ermittelt. Im ersten Schritt der Strukturbestimmung wurden die 15N,13C- und 1H-Resonanzen der in den stabilen Isotopen angereicherten Proteinspezies zugeordnet. Die Rückgratresonanzen der 1HN, 15N, 1Ha, 13Ca, und 13CO-Atome (sowie der 1Hß. und 13Cß.Seitenkettenatome ) wurden mit Hilfe verschiedener Tripleresonanz- Experimente zugeordnet. Unter anderem wurden HNCACB-, HN(CA)CO-, HNCO-, HN(CA)N-, HNCA-, HNCO-, und HCACO-Experimente verwendet. Die sequenzielle Zuordnung der Resonanzen des Proteinrückgrats war annähernd vollständig, mit Ausnahme der Resonanzen der Reste 90-94. Aus CC(CO)NH- und CC(CA)NH-Experimenten für aliphatische 13C Resonanzen und H(C)CH-COSY- und H(C)CH-TOCSY-Experimenten für aliphatische Protonresonanzen wurden die Seitengruppenatome (1H und 13C) zugeordnet. Mit Hilfe eines zwei-dimensionalen homonuklearen NOESY-Spektrums und eines zwei-dimensionalen homonuklearen TOCSY-Spektrums einer unmarkierten Probe in D2O ließen sich die Resonanzen von aromatischen Protonen zuordnen. Stereospezifische Zuordnungen der Isopropylgroppen von Val-und Leu-Resten wurden mit Hilfe einer biosynthetischen Methode bestimmt. Insgesamt wurden 74% aller Protonenresonanzen zugeordnet. Die fehlenden Seitenkettenzuordnungen liegen vor allem in Seitenketten langer Aminosäurereste. Stereospezifische Zuordnungen konnten von 20 Isopropylgroupen von 21 Val- und Leu-Resten bestimmt werden. Für die meisten aromatischen Aminosäuren wurden auch die labilen Protonen der aromatischen Ringe zugeordnet. Um die NOE-Signale zwischen den Untereinheiten des Dimers zuzuordnen, wurde ein drei-dimensionales 15N-editiertes NOESY-HSQC-Experiment einer Mischung aus Untereinheiten von 2H/15N-markierten und nicht isotopenmarkierten Monomeren (Ferentz, et al., 1997) und ein vier-dimensionales J-editiertes 1H-13C-NOESY Experiment (Melacini et al., 2000) einer Probe aus 13C- 1H und nicht markierten Untereinheiten aufgenommen. Das erste Experiment lieferte 3 NOE-Signale zwischen den Amidprotonen von der 2H/15N-markierten Untereinheit zu den C-gebundenen Protonen der unmarkierten Untereinheit. Das letztere lieferte 5 weitere NOESYSignale, wobei dieses Experiment eine klare Trennung von inter- and intramolekularen NOEs ermöglichte. Insgesamt konnten 8 NOE-Signale zwischen den beiden Untereinheiten des Dimers bestimmt werden. Diese Signale lagen im Kontaktbereich zwischen den Untereinheiten, wobei die Aminosäurereste F7, D8, T10 und F11 einer Untereinheit und A75 and Y105 der anderen Untereinheit beteiligt waren. Die Struktur stützt sich auf 2688 aus NOE-Werten abgeleiteten Abstandsparametern, auf Wasserstoffbrücken, die aus 34 langsam austauschenden Rückgrat-Amidprotonenresonanzen abgeleitet wurden sowie auf 334 Torsionswinkel, die mit Hilfe des TALOS-Programm erhalten wurden. Für die Verfeinerung der Struktur wurden auch 158 residuale dipolare Kopplungsparameter (RDC) verwandt. Die drei-dimensionale Struktur des Sud-Proteins wurde mit einem gemittelten RMSDWert von 0,72 Å und 1,28 Å für die Rückgrat- und schweren Atome bestimmt, wobei die terminalen Reste auszunehmen sind. Ohne das nur schlecht definierte Segment der Reste 90 bis 95 würde der mittlere RMSD-Wert auf 0,6 Å und 1,14 Å absinken. Das Ensemble der Strukturen, das mit den residualen dipolaren Kopplungen verfeinert wurde, zeigt eine gute Konvergenz. Die entsprechenden RMSD-Werte, wenn man die Werte für die Reste 90 bis 94 ausnimmt, sinken durch die RDC-Verfeinerung auf 0,97 und 0,66 Å. Die relative Orientierung der beiden Monomeren in der Proteinstruktur, die mit den residualen dipolaren Kopplungsparametern verfeinert wurden, sind auch unterschiedlich zu denen, die ohne die residualen dipolaren Kopplungsparameter bestimmt wurden. Die Struktur des dimeren Sud-Proteins wurde aus den beschriebenen Abstands-, RDC- und Winkelparametern mit Hilfe des ARIA-Programmpakets berechnet. Um der ambivalenten Zuordnungsmöglichlkeit von NOESY-Signalen innerhalb einer Untereinheit bzw. zwischen den Untereineinheiten Rechnung zu tragen, wurde eine eine ADR-Funktion (ambiguous distance restraints), welche beide Möglichkeiten berücksichtig, verwendet. Die Strukturbestimmung des dimeren Proteins wurde erheblich behindert, nicht nur durch das hohe Molekulargewicht (30 kDa) und die dadurch bedingte Überlappung von Signalen sondern auch durch die nur geringe Anzahl von experimentellen intermonomer auftretenden NOE-Werten. Somit war die relative Orientierung der beiden Monomeren zueinander unsicher. Einige der Resonanzen der aliphatischen Seitenketten konnten wegen der ausgeprägten Signalüberlappung nicht zugeordnet werden. Das dimere Sud-Protein enthält 17 Lysin-, 14 Leucinreste und 1 Histidin-Tag für jede Untereinheit. Diese Häufigkeit komplizierte die Resonanzzuordnung. Auch das konventionelle 3D-15N-getrennte TOCSY-HSQC-Experiment versagte, weil die Linienbreiten wegen des hohen Molekulargewichts zu groß waren. Die Lösungsstruktur enthält ein fünfsträngiges paralleles ß-Faltblatt, das eine hydrophobe Region enthält sowie ein zweisträngiges antiparalleles ß-Faltblatt und sieben a-Helices. Die dimere Struktur wird hauptsächlich durch hydrophobe Reste stabilisiert. Da das Sud-Protein auch den Transfer des Polysulfidschwefels zu Cyanid katalysiert, erschien eine Ähnlichkeit zum Protein Rhodanese aus Azotobacter vinelandii gegeben. Die beiden Proteine sind im aktiven Zentrum sehr ähnlich, besonders in der Konformation der Schlaufe des aktiven Zentrums mit dem freien Cystein und im Hinblick auf die umgebenden positiv geladenen Reste. Die Schlaufe des aktiven Zentrums (Reste 89-95) im Sud-Protein erscheinen flexibel. Diese Flexibilität wiederum verhindert die Möglichkeit der Zuordnung von Protonenresonanzen der Reste 90-94. Trotz dieser Ähnlichkeit in der Funktion und dem aktiven Zentrum sind die Aminosäuresequenzen und die Sekundärstrukturelemente der beiden Proteine bemerkenswert unterschiedlich. Die negativ geladene Polysulfidkette wechselwirkt mit den positiv geladenen Resten R46, R67 und R94 und wird dadurch in der Struktur stabilisiert. Der Austausch einer der 3 Argininreste, die auch in der Rhodanese von Azotobacter vinelandii konserviert sind, führt zum Verlust der Aktivität des Schwefeltransfers. Um den Mechanismus des Polysulfidschwefeltransfers zu verstehen, wurden die mit 10 Polysulfidschwefelatomen gebundene Strukturen berechnet. Die Reste R46, D47, E50, K90, T91, A92, R94 bilden mit den Resten K90', T91' und K119' der anderen Untereinheit (') einen Kanal und umgeben die an das Cystein 89 gebundene Polysulfidkette. Diese Anordnung erlaubt es der Polysulfidkette sich vom Inneren des Sud-Proteins zu den weiter außen liegenden Resten R67 and K119' zu erstecken. Aus Resonanzverschiebungen in HSQC-Spektren läßt sich schließen, daß die Reste R67 und K119' wahrscheinliche Kandidaten für die für den Schwefeltransfer relevanten Wechselwirkungen mit der Polysulfidreduktase darstellen. Auuserdem könnte T91, welches in der Schlaufe des aktiven Zentrums liegt, für die Stabilisierung der Polysulfidkette eine Rolle spielen