Spectroscopic investigation of stability, unfolding and refolding of outer membrane protein porin from Paracoccus denitrificans

Stability, unfolding and refolding of the outer membrane protein porin from Paracoccus denitrificans was investigated using genetic and spectroscopic methods. Structural and functional activity studies on wild type and mutant porins: The site-directed mutants were constructed based on conserved residues and evidences on the role of certain amino acids from previous studies with OmpF. Secondary structure analysis of wild type and mutants E81Q, W74C, E81Q/D148N, E81Q/D148N/W74C by FTIR and CD spectroscopy are in line with the fact that porins are predominantly ß-sheet structure. The functional activity studies by black lipid bilayer techniques showed that the wild type and mutants W74C, E81Q/D148N, E81Q/D148N/W74C have a conductance of 3.25 nS. For mutant E81Q conductance of 1.25nS was more predominant over 3.25 nS. The activity of the mutants was observed to be far less than the wild type. This indicates that structural similarities does not implies similar functional activity. Thermal stability analysis of porin in detergent micelles and reconstituted into liposomes: Thermal stability analysis of wild type and mutants in detergent micelles showed changes in secondary and quaternary structure. It was found that wild type porin unfolds into aggregated structure with a high transition temperature of 86.2 °C. For mutants E81Q, W74C, E81Q/D148N the transition temperature was found to be 84.2 °C, 80.3 °C and 80.2 °C respectively. Functional activity assays at high temperatures revealed that the protein tends to loose its activity on heating up to 50 °C. This shows that structural stability does not imply functionality in the case of porins. Thermal stability analysis of porin reconstituted into liposomes showed that there was no change in the secondary and quaternary structure of the protein up to 100 °C, revealing that the protein becomes more thermostable when it is reconstituted into liposomes. Refolding of aggregated porin: This study shows that disaggregation of ß-sheet membrane protein porin is possible by changing its chemical and thermodynamic parameters. An increase of the solution pH to 12 or above results in opening up of the aggregated protein into unordered structure, as observed by FTIR and CD spectroscopy. This unordered structure could be refolded into native-like structure forming trimers. The secondary structure of the refolded protein deviated slightly from the native one. The thermal stability analysis of the native-like refolded proteins showed that the unfolding pattern is entirely different when compared to the native porins. pH dependent unfolding of porin: Thermal stability of porin at different pH values showed that the protein is stable in a pH range of 1-11. At pH 12 and above the protein unfolds into unordered structure instead of aggregating. The high pH unfolding of porin is a reversible process. The secondary structure of the refolded protein varied slightly from the native-one. Whereas thermal stability was entirely different. This shows that even though the unfolding of porin at high pH is reversible, it results in changes in local interaction between the amino acids resulting in a difference in stability. Unfolding in presence of urea and guanidinium hydrochloride (GuHCl): Denaturation of porin in the presence of chemical denaturants like urea and GuHCl showed that porin unfold into unordered structure. The unfolding is a reversible process. Unfolded protein was refolded into detergent micelles and liposomes. Refolding into detergent micelles was faster compared to refolding into liposomes, as seen by kinetic gel shift assays. The refolding into liposomes showed the presence of intermediates similar to those reported for OmpF. This study shows the difference in thermal stability of the outer membrane protein porin from Paracoccus denitrificans in detergent micelles and native-like liposomes. It suggests various unfolding pathways, which can be further investigated for unfolding and refolding kinetics. This report also suggests that it is possible to refold a heat-aggregated protein.In der vorliegenden Arbeit werden die Stabilität, das Entfalten und Rückfalten des Außenmembranproteins Porin von Paracoccus denitrificans untersucht. Durch Mutagenese wurden Proteinmutanten hergestellt und mit Hilfe der Fourier Transform Infrarot (FTIR)-, Zirkulardichroismus (CD)- und Fluoreszenz-Spektroskopie Änderungen in der Sekundärstruktur und in Tryptophan-Regionen des Proteins verfolgt. Konstruktion der Mutanten und Proteinreinigung Das Protein des Wildtyps und der Mutanten E81Q, W74C, E81Q/D148N, E81Q/D148N/W74C wurde bezüglich Struktur und Funktion charakterisiert. Die Auswahl der ortsgerichteten Mutationen basieret auf konservierten Aminosäuren und auf vorangegangenen Studien mit OmpF. Analyse der Sekundärstruktur und der funktionellen Aktivität Die Sekundärstrukturanalyse des Wildtyps und der Porinmutanten sind in Übereinstimmung mit dem Befund, dass Porine vorwiegend β-Faltblattstruktur besitzen. Die Daten aus der Röntgenstrukturanalyse werden durch die Ergebnisse dieser Arbeit unterstützt. Untersuchungen über die funktionelle Aktivität mit Hilfe von Lipiddoppelschichten zeigen, dass der Wildtyp und die Mutanten W74C, E81Q/D148N und E81Q/D148N/W74C eine Leitfähigkeit von 3,25 nS, bezogen auf das einzelne Protein besitzen. Das beobachtete Ergebnis steht in Einklang mit den Leitfähigkeitsmessungen, die für Porin von Paracoccus denitrificans und andere nicht spezifische Porine berichtet werden. Die Leitfähigkeit der Mutante E81Q beträgt 1,25 nS und ist damit auffällig niedrig. Die Aktivität der Mutanten ist um einiges geringer als die vom Wildtyp. Messungen der relativen Aktivität zeigen, dass die Mutanten E81Q und W74C nur 20% der Aktivität des Wildtyps besitzen. Für E81Q/D148N beträgt die Aktivität nur 10%. Der Grund für die reduzierte Aktivität liegt wahrscheinlich darin, dass das Porin nicht nur in der stabilen Trimerform, sondern auch als Monomere und Dimere vorliegt. Dies zeigt, dass eine strukturelle Ähnlichkeit nicht unbedingt eine vergleichbare funktionelle Aktivität bedeutet. Analyse der thermischen Stabilität von Porin in Detergensmizellen und in Liposomen Die Analyse der thermischen Stabilität des Wildtyps und der Mutanten zeigt, dass diese Proteine sehr stabil sind. Entfalten des Proteins bei hohen Temperaturen führt zur Aggregation in Detergensmizellen mit einer Übergangstemperatur (TM) von 86,2 °C für den Wildtyp bzw. 84,2 °C, 80,3 °C und 80,2 °C für die Mutanten E81Q, W74C und E81Q/D148N. Obwohl der Hauptteil des Proteins, wahrscheinlich der β-Faltblatt-Bereich, an der Aggregatbildung beteiligt ist, gibt es Hinweise darauf, dass einige Proteinbereiche auch in ungeordnete Struktur entfalten, da Banden verschwinden, die charakteristisch für Loop- und Helix-Bereiche sind und zusätzlich eine Bande erscheint, die eine ungeordnete Struktur kennzeichnet. Die Analyse mit SDS-PAGE zeigt, dass das Protein bei Temperaturen nahe 90 °C monomerisiert, was somit bedeutet, dass das Erwärmen des Proteins bis zu seiner Übergangstemperatur Veränderungen in seiner Sekundär- und Quartärstruktur erzeugt. Funktionelle Aktivitätsbestimmungen bei hohen Temperaturen machen deutlich, dass das Protein dazu tendiert, beim Erwärmen seine Aktivität zu verlieren. Dies bedeutet, dass im Fall von Porinen eine strukturelle Stabilität nicht gleichbedeutend mit einer funktionellen ist. Die Analyse der thermischen Stabilität von Porin, das in Liposomen rekonstituiert wurde, zeigt, dass bis zu 100°C keine Veränderung in der Sekundär- oder Quartärstruktur des Proteins stattfindet, was deutlich macht, dass das Protein durch die Rekonstitution in Liposomen noch weiter stabilisiert wird. Der Unterschied der thermischen Stabilität von Porin in Detergensmizellen und Liposomen kann durch Änderungen in der Umgebung von Residuen belegt werden, insbesondere die von Tyrosinen, was durch die Analyse der Ring C-C Streckschwingung bei 1515 cm-1 untersucht werden kann. Aus der Analyse dieser Tyrosinschwingung in Detergensmizellen und in Liposomen kann gefolgert werden, dass bei Porin in Detergensmizellen eine Verschiebung dieser Mode zu kleineren Wellenzahlen erfolgt, wohingegen die Bandenposition in Liposomen bis 80 °C annähernd konstant bleibt. Oberhalb dieser Temperatur konnte aufgrund von Verdampfen ein Verlust von Wassermolekülen nicht vermieden werden, was eine unspezifische Veränderung der Umgebung der Tyrosinreste und damit auch der Bandenposition zu Folge hat. Rückfalten des aggregierten Porins Aggregation wird im Allgemeinen als der Endzustand des Proteins beim Denaturieren angenommen und kann als vollständig irreversibel bezeichnet werden. Diese Studie zeigt jedoch, dass die Desaggregation des ß-Faltblatt Membranproteins Porin durch die Veränderung seiner Umgebung möglich ist. Eine Erhöhung des pH-Wertes des Lösungsmittels auf 12 oder höher resultiert in einem Öffnen des aggregierten Proteins in eine ungeordnete Struktur, was durch FTIR und CD Spektroskopie dokumentiert wird. Diese ungeordnete Struktur kann in eine nativ-ähnliche Struktur zurückgefaltet werden, welche Trimere bildet. Diese so gebildete nahezu native Struktur zeigt charakteristischesβ-Faltblatt, allerdings weicht die Position der Amid I Bande leicht von der der nativen Struktur ab. Trotzdem wird durch diese Untersuchung gezeigt, dass aggregiertes Protein ohne jegliche Chaperone, sondern allein durch das Verändern chemischer und thermodynamischer Parameter rückgefaltet werden kann. Die thermische Stabilität des zurückgefalteten nativ-ähnlichen Porins ist vollkommen unterschiedlich. Beim erneuten Erwärmen entfalten diese Proteine in ungeordnete Struktur und nicht in Aggregate. Desweiteren bleibt die ungeordnete Struktur sogar beim Abkühlen erhalten, das heißt, dass von nun an das Entfalten irreversibel ist. pH abhängiges Entfalten des Porins Die Untersuchung der thermischen Stabilität von Porin bei unterschiedlichen pH-Werten zeigt, dass sich das Protein in einem pH-Bereich zwischen 1 und 11 ähnlich verhält. In diesem pH- Bereich entfaltet das Protein irreversibel in Aggregate. Obwohl die Übergangstemperatur bei saurem pH von 1,5 und 4 abnimmt, ist sie nur ein paar Grad niedriger als bei pH 8. Bei pH 12 entfaltet das Protein in ungeordnete Struktur, anstatt zu aggregieren. Dies bedeutet, dass sich die Stabilität des Proteins bei höherem pH-Wert ändert. Auch das Entfalten oberhalb eines pH-Wertes von 12 resultiert in ungeordneter Struktur, die Reaktion ist aber langsam und braucht zur Vervollständigung ungefähr eine Stunde. Das Entfalten des Porin bei hohem pH ist ein reversibler Prozess. Beim Rückfalten werden nativ-ähnliche Strukturen gebildet, was spektroskopisch und durch das Entstehen von Trimeren in SDS-PAGE Gelen überprüft wurde. Das zurückgefaltete Protein wird nativ-ähnlich genannt, weil in den FTIR Spektren die Amid I Banden für β-Faltblatt zwar auftreten, jedoch die Bandenpositionen bei 1625 cm -1 und 1687 cm -1 leicht von denen der nativen Form abweichen. Die thermische Stabilität des zurückgefalteten nativ-ähnlichen Porins ist vollkommen anders als beim nativen Protein, da es beim Erwärmen zunächst in eine ungeordnete und nicht in eine aggregierte Struktur entfaltet und erst beim erneuten Abkühlen aggregiert. Obwohl das Entfalten von Porin bei hohem pH reversibel ist, wird deutlich, dass sich lokale Wechselwirkungen zwischen Aminosäuren verändern, was in einer unterschiedlichen Stabilität resultiert. Hier wäre es wichtig, zu verstehen, wie diese unterschiedlichen Wechselwirkungen von denen der nativen Struktur abweichen. Entfalten durch Harnstoff und Guanidiniumhydrochlorid Die Denaturierung von Porin mit Hilfe von chemischen Denaturierungsmittel wie Harnstoff und Guandiniumhydrochlorid entfaltet dass Porin in eine ungeordnete Struktur. Das Entfalten hängt fast linear von der Konzentration ab und ist ein reversibler Prozess. Entfaltetes Protein wurde sowohl in Detergensmizellen als auch in Liposomen zurückgefaltet. Die spektroskopische Aufnahme der Bildung von β-Faltblatt Struktur zeigt in beiden Fällen Faltungszeiten unter 4 Minuten. Das Rückfalten in Detergensmizellen ist verglichen mit dem Rückfalten in Liposomen schneller, was durch eine SDS-PAGE Analyse beobachtet wurde. Im Gel werden beim Rückfalten in Detergensmizellen keine Intermediate beobachtet, wohingegen für Liposomen Intermediate auftreten, ähnlich wie sie für OmpF beobachtet werden. Diese Arbeit zeigt Unterschiede in der thermischen Stabilität des Außenmembranproteins Porin von Paraccocus denitrificans in Detergensmizellen und nativ-ähnlichen Liposomen auf. Mehrere Entfaltungswege werden vorgeschlagen, die bezüglich Entfaltungs- und Rückfaltungskinetiken weiter untersucht werden können. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass es möglich ist, ein durch Erwärmen aggregiertes Protein in eine nativ-ähnliche Proteinstruktur zurückzufalten