Mechanistische Auswirkungen der schwedischen APP-Mutation und des Caspase-3-gespalteten c-terminalen Presenilin-Fragments auf die neurotoxischen Effektive von Beta Amyloid

Alzheimer’s disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder world wide, causing presenile dementia and death of millions of people. During AD damage and massive loss of brain cells occur. Alzheimer’s disease is genetically heterogeneous and may therefore represent a common phenotype that results from various genetic and environmental influences and risk factors. In approximately 10% of patients, changes of the genetic information were detected (gene mutations). In these cases, Alzheimer’s disease is inherited as an autosomal dominant trait (familial Alzheimer’s disease, FAD). In rare cases of familial Alzheimer’s disease (about 1-3%), mutations have been detected in genes on chromosomes 14 and 1 (encoding for Presenilin 1 and 2, respectively), and on chromosome 21 encoding for the amyloid precursor protein (APP), which is responsible for the release of the cell-damaging protein amyloid-beta (ß-amyloid, Aß). Familial forms of early-onset Alzheimer’s disease are rare; however, their importance extends far beyond their frequency, because they allow to identify some of the critical pathogenetic pathways of the disease. All familial Alzheimer mutations share a common feature: they lead to an enhanced production of the Aß, which is the major constituent of senile plaques in brains of AD patients. New data indicates that Aß promotes neuronal degeneration. Therefore, one aim of these thesis was to elucidate the neurotoxic biochemical pathways induced by Aß, investigating the effect of the FAD Swedish APP double mutation (APPsw) on oxidative stress-induced cell death mechanisms. This mutation results in a three- to sixfold increased Aß production compared to wild-type APP (APPwt). As cell models, the neuronal PC12 (rat pheochromocytoma) and the HEK (human embryonic kidney 293) cell lines were used, which have been transfected with human wiltyp APP or human APP containing the Swedish double mutation. The used cell models offer two important advantages. First, compared to experiments using high concentrations of Aß at micromolar levels applied extracellularly to cells, PC12 APPsw cells secret low Aß levels similar to the situation in FAD brains. Thus, this cell model represents a very suitable approach to elucidate the AD-specific cell death pathways mimicking physiological conditions. Second, these two cell lines (PC12 and HEK APPwt and APPsw) with different production levels of Aß may additionally allow to study dose-dependent effects of Aß. The here obtained results provide evidence for the enhanced cell vulnerability caused by the Swedish APP mutation and elucidate the cell death mechanism probably initiated by intracellulary produced Aß. Here it seems likely that increased production of Aß at physiological levels primes APPsw PC12 cells to undergo cell death only after additional stress, while chronic high levels in HEK cells already lead to enhanced basal apoptotic levels. Crucial effects of the Swedish APP mutation include the impairments of cellular energy metabolism affecting mitochondrial membrane potential and ATP levels as well as the additional activation of caspase 2, caspase 8 and JNK in response to oxidative stress. Thereby ,the following model can be proposed: PC12 cells harboring the Swedish APP mutation have a reduced energy metabolism compared to APPwt or control cells. However, this effect does not leads to enhanced basal apoptotic levels of cultured cells. An exposure of PC12 cells to oxidative stress leads to mitochondrial dysfunction, e.g., decrease in mitochondrial membrane potential and depletion in ATP. The consequence is the activation of the intrinsic apoptotic pathway releasing cytochrome c and Smac resulting in the activation of caspase 9. This effect is amplified by the overexpression of APP, since both APPsw and APPwt PC12 cells show enhanced cytochrome c and Smac release as well as enhanced caspase 9 activity as vector transfected control. In APPsw PC12 cells a parallel pathway is additionally emphased. Due to reduced ATP levels or enhanced Aß production JNK is activated. Furthermore, the extrinsic apoptotic pathway is enhanced, since caspase 8 and caspase 2 activation was clearly enhanced by the Swedish APP mutation. Both pathways may then converge by activating the effector enzyme, caspase 3, and the execution of cell death. In addition, caspase independent effects also needs to be considered. One possibility could be the implication of AIF since AIF expression was found to be induced by the Swedish APP mutation. In APPsw HEK cells high chronic Aß levels leads to enhanced apoptotic levels, reduce mitochondrial membrane potential and ATP levels even under basal conditions. Summarizing, a hypothetical sequence of events is proposed linking FAD, Aß production, JNK-activation, mitochondrial dysfunction with caspase pathway and neuronal loss for our cell model. The brain has a high metabolic rate and is exposured to gradually rising levels of oxidative stress during life. In Swedish FAD patients the levels of oxidative stress are increased in the temporal inferior cortex. This study using a cell model mimicking the in vivo situation in AD brains indicates that probably both, increased Aß production and the gradual rise of oxidative stress throughout life converge at a final common pathway of an increased vulnerability of neurons to apoptotic cell death from FAD patients. Presenilin (PS) 1 is an aspartyl protease, involved in the gamma-secretase mediated proteolysis of Amyloid-ß-protein (Aß), the major constituent of senile plaques in brains of Alzheimer’s disease (AD) patients. Recent studies have suggested an additional role for presenilin proteins in apoptotic cell death observed in AD. Since PS 1 is proteolytic cleaved by caspase 3, it has been prosposed that the resulting C-terminal fragment of PS1 (PSCas) could play a role in signal transduction during apoptosis. Moreover, it was shown that mutant presenilins causing early-onset of familial Alzheimer's disease (FAD) may render cells vulnerable to apoptosis. The mechanism by which PS1 regulates apoptotic cell death is yet not understood. Therefore one aim of our present study was to clarify the involvement of PS1 in the proteolytic cascade of apoptosis and if the cleavage of PS1 by caspase 3 has an regulatory function. Here it is demonstrated that both, PS1 and PS1Cas lead to a reduced vulnerability of PC12 and Jurkat cells to different apoptotic stimuli. However a mutation at the caspase 3 recognition site (D345A/ PSmut), which inhibits cleavage of PS1 by caspase 3, show no differences in the effect of PS1 or PSCas towards apoptotic stimuli. This suggest that proteolysis of PS1 by caspase 3 is not a determinant, but only a secondary effect during apoptosis. Since several FAD mutation distributed through the whole PS1 gene lead to enhanced apoptosis, an abolishment of the antiapoptotic effect of PS1 might contribute to the massive neurodegeneration in early age of FAD patients. Here, the regulate properties of PS1 in apoptosis may not be through an caspase 3 dependent cleavage and generation of PSCas, but rather through interaction of PS1 with other proteins involved in apoptosis.Massiver und fortschreitender neuronaler Zelltod gehört zu den zentralen Charakteristika der Alzheimer Demenz (AD), ebenso wie Senile Plaques und Neurofibrillenbündel. Die Aufklärung der Mechanismen, die zum neuronalen Zelltod führen, sind daher von entscheidender Bedeutung bei der Suche nach neuen therapeutischen Ansätzen. Verantwortlich für den neuronalen Zelltod ist das Amyloid-Beta Peptid (Aß), das ein proteolytisches Spaltprodukt des Amyloid Precursor Proteins (APP) ist. Die Spaltung von Aß erfolgt hierbei initial durch die ß-Sekretase und anschließend intermembranär durch den gamma-Sekretase Komplex. Aß wird intrazellulär generiert und extrazellulär in aggregierten und unlöslichen Plaques angereichert. Die Mechanismen der Aß-Toxizität sind noch nicht genau bekannt; assoziiert werden oxidativer Stress, veränderte Kalziumhomöostase, mitochondriale Defekte und der Verlust an Überlebensfaktoren. Weniger als 10% aller Fälle der AD werden dominant vererbt. Dies bedeutet, dass die Mutation eines einzigen Gens für die Entstehung der Krankheit ausreicht und dass statistisch gesehen die Hälfte der Nachkommen eines Betroffenen ebenfalls erkranken. Bisher sind drei Gene bekannt, die bei autosomal dominant vererbten Formen der AD (familiäre AD, FAD) mutiert sein können. Es handelt sich um die Gene Presenilin 1 und Presenilin 2 auf den Chromosomen 14 bzw. 1, sowie um das auf Chromosom 21 gelegene Gen für das Amyloid- Precursor-Molekül (APP). Die familiären Formen der AD sind selten, deren Bedeutung ragt jedoch weit über die Auftrittsfrequenz hinaus, weil sie es erlauben die kritische pathogenene Entwicklung der Krankheit in transgenen Modellen zu untersuchen. Alle familiären AD Mutationen haben eines gemeinsam; sie führen zu einer erhöhten Produktion von Aß. Basierend auf Daten, die darauf hindeuten, dass Aß die neuronale Degeneration fördert, war es das Hauptziel der vorliegenden Arbeit, die neurotoxischen biochemischen Signaltransduktionswege von Aß zu untersuchen. Hierfür wurde der Effekt, der im Rahmen der FAD vorkommenden, schwedischen APP Mutation (APPsw), auf den durch oxidativen Stress induzierten Zelltodmechanismus untersucht. Diese Mutation resultiert in einer drei- bis sechsfach erhöhten Aß Produktion im Vergleich zum Wild-Typ APP (APPwt). Als Zellmodell wurden die neuronalen PC12- (rat pheochromocytoma) und die HEK- (human embryonic kidney 293) Zelllinien verwendet, die zuvor mit APPsw-, APPwt-, und als Kontrolle mit Leervektoren transfiziert wurden. Die verwendeten Zellmodelle bieten hierbei zwei wichtige Vorteile. 1. Verglichen mit Experimenten, bei denen Aß extrazellulär im mikromolaren Bereich appliziert wird, sekretieren PC12 APPsw Zellen Aß im pikomolaren Bereich, entsprechend der physiologischen Produktion im Gehirn von AD Patienten. So stellt dieses Zellmodell eine sehr gute Annäherung an die tatsächlich physiologische Situation in Gehirnen von FAD Patienten dar. 2. Beide Zelllinien (PC12 und HEK, APPwt und APPsw) haben eine unterschiedliche Aß Produktion, was die Untersuchung von dosisabhängigen Aß-Effekten ermöglicht. Die in dieser Arbeit gefundenen Ergebnisse zeigen, dass die Transfektion der schwedischen APP Mutation eine erhöhte Zellvulnerabilität bewirkt. Ebenso wurden die, wahrscheinlich von Aß induzierten, Zelltodmechanismen aufgeklärt. Interessanterweise konnte hierbei festgestellt werden, dass die unter physiologischen Bedingungen erhöhte Aß Produktion in PC12 Zellen erst dann zu einer erhöhte Apoptoserate führt, wenn eine sekundäre Stressinduktion stattfindet. Ein Einfluss der erhöhten APP Expression oder der erhöhten Aß Produktion auf die basale Apoptose (ohne sekundäre Stressinduktion) konnte in PC12 Zellen nicht festgestellt werden. Die mit der schwedischen APP Mutation transfizierten HEK Zellen weisen eine 30fach erhöhte Aß Produktion im Vergleich zu den entsprechend transfizierten PC12 Zellen auf. Dies hat zur Folge, dass die chronisch erhöhte Aß Produktion in HEK Zellen auch schon unter basalen Bedingungen zu einer erhöhten Apoptoserate führt. Untersuchungen des mitochondrialen Membranpotentials und der zellulären ATP Spiegel zeigten, dass die ausschlaggebenden Effekte der schwedischen APP Mutation die Beeinträchtigung des zellulären Energiemetabolismus beinhalten. Sowohl basale ATP Spiegel als auch ein reduziertes mitochondriales Membranpotential wurden in APPsw- transfizierten HEK Zellen im Vergleich zu den APPwt Zellen gemessen. Auch APPsw- transfizierte PC12 Zellen haben einen reduzierten Energiemetabolismus wie die Untersuchung der ATP-Spiegel und der metabolischen Aktivität zeigten. Dies wird aber unter basalen Bedingungen jedoch anscheinend kompensiert. Ein zentraler Aspekt der vorliegenden Arbeit war es, die Frage zu beantworten, warum die Überexpression von APP zu einer erhöhten Vulnerabilität gegenüber oxidativen Stress bei PC12 Zellen führt. Auch sollte geklärt werden, wie die Überexpression der schwedischen APP Mutation diesen Effekt noch zusätzlich verstärkt. Hierfür wurden verschiedene Signaltransduktionswege des apoptotischen Zelltods untersucht. Wie es sich herausstellte, scheint die Beeinträchtigung der mitochondrialen Funktion eine wesentliche Auswirkung der APP-Überexpression zu sein. Eine Induktion von oxidativem Stress führte in PC12 Zellen zu einer Aktivierung der intrinsischen Apoptosekaskade, mit einer Freisetzung von Cytochrom C und Smac, sowie einer resultierenden Aktiverung der Initiatorcaspase 9. Die intrinsische Apoptose wird hierbei durch die Überexpression von APP verstärkt. Sowohl APPsw als auch APPwt PC12 Zellen wiesen eine erhöhte Cytochrom C- und Smac- Freisetzung in das Cytosol auf, im Vergleich zu Vector-transfizierten PC12 Zellen. Ebenso wurde eine erhöhte Caspase 9 Aktivität bei APPsw- und APP-transfizierten Zellen im Vergleich zu den Vektor- transfizierten Zellen gemessen. Weitere Untersuchungen zeigten, dass die schwedische APP Mutation darüber hinaus noch eine zusätzliche Aktivierung von Caspase 2 und Caspase 8 bewirkt wenn PC12 Zellen oxidativem Stress ausgesetzt sind. Eine deutlich erhöhte Caspase 2- und Caspase 8-Aktivität konnte in APPsw- transfizierten Zellen im Vergleich zu APPwt PC12 Zellen gemessen werden. Da dies zwei Initiatorcaspasen sind, die normalerweise extrazelluläre Zelltodsignale vermitteln, deutet das auf eine Aktivierung der extrinsischen Apoptose. Ebenso konnte gezeigt werden, dass sowohl in HEK Zellen als auch in PC12 Zellen die Induktion von oxidativem Stress zu einer Aktivierung der c-Jun terminalen Kinase (JNK) führt. Interessanterweise konnte gefunden werden, dass die Aktivierung der JNK durch die schwedische APP Mutation verstärkt wird, was auf eine wichtige Rolle der JNK im Rahmen der Aß Toxizität hindeutet. In PC12 Zellen konnte zusätzlich beobachtet werden, dass die Inhibierung von JNK mit SP600125, einem spezifischen JNK Inhibitor, Mitochondrien vor dem, durch oxidativen Stress induzierten, Zusammenbrechen des Membranpotential schützt. Auch konnte aktiviertes JNK in der mitochondrialer Fraktion nachgewiesen werden, was ebenso darauf hindeutet, dass JNK zusätzlich zu der Aktivierung des Transkriptionsfaktors c-Jun auch Signale zu Mitochondrien vermittelt. Ausgehend von diesen Ergebnissen kann die erhöhte Vulnerabilität der APPsw- transfizierten Zellen bei der Induktion von oxidativen Stress folgendermaßen nachvollzogen werden: APPsw- transfizierte PC12 Zellen haben einen reduzierten Energiemetabolismus im Vergleich zu APPwt- und Vektor- transfizierten PC12 Zellen. Der beeinträchtigte Zellmetabolismus wird anscheinend jedoch kompensiert, da dieser Effekt alleine nicht zu einer erhöhten basalen Apoptoserate führt. Eine zusätzliche Induktion von oxidativem Stress führt dann zu einen weiteren Abfall des mitochondrialen Membranpotentials und der ATP Spiegel. Die Folge ist eine Aktivierung der intrinsichen Apoptosekaskade, mit einer Freisetzung von Cytochrom C und Smac und einer Aktivierung der Caspase 9. Diese Effekte werden hierbei durch die Überexpression von APP verstärkt. Die schwedische APP Mutation führt gleichzeitig aber auch zur Verstärkung parallel verlaufender Signale. Aufgrund der reduzierten ATP-Spiegel oder der erhöhten Aß Produktion findet eine zusätzliche Aktivierung der JNK statt. Ebenso findet zusätzlich eine verstärkte Aktivierung der extrinsischen Apoptosekaskade statt, da eine deutlich erhöhte Caspase 8- und Caspase 2- Aktivierung bei der Induktion von oxidativem Stress in APPsw PC12 Zellen auftritt. Beide Signalwege führen zur Aktivierung der Caspase 3, die als Effektor Caspase den Zelltod vollstreckt. Zusätzlich müssen aber auch noch Caspase unabhängige Effekte berücksichtigt werden. Eine Möglichkeit besteht in der Aktivierung von AIF, da eine verstärkte AIF Expression induziert durch die schwedische APP Mutation nachgewiesen wurde. In APPsw transfizierten HEK Zellen führen chronisch erhöhte Aß Spiegel selbst unter basalen Bedingungen zu einer erhöhten Apoptoserate, einem reduzierten mitochondrialen Membranpotential und reduzierten ATP Spiegeln. Zusammenfassend wird aus den hier erzielten Ergebnissen eine hypothetische Sequenz vorgeschlagen, wie es zum frühen Einsetzen der FAD kommen könnte: das Gehirn hat eine hohe metabolische Aktivität und ist im Laufe des Lebens einer zunehmenden Menge an oxidativem Stress ausgesetzt. Bei Patienten, die Träger der schwedischen APP Mutation sind, wurden in der Hirnrinde erhöhte Level an oxidativen Stress festgestellt. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Versuche, zeigen, dass sowohl eine erhöhte Aß Produktion als auch die zunehmende Menge an oxidativem Stress zu einer erhöhten Vulnerabilität von Neuronen bei FAD Patienten führt. Entscheidend sind hierbei die Aktivierungen von Caspase 2, Caspase 8 und JNK Dies hat ein verstärktes Absterben von Neuronen durch den apoptotischen Zelltod und ein frühes Eintreten von Morbus Alzheimer zur Folge. Im Rahmen der familiären Alzheimer Erkrankung wurden bisher über 120 Mutationen im Presenilin 1 Gen gefunden. Ebenso wie bei Mutationen innerhalb des APP Gens führen auch die Presenilin Mutationen zu einer erhöhten Aß Bildung. Wie vor kurzem nachgewiesen werden konnte, ist Presenilin 1 ein transmembranäres Protein mit 6-8 Transmembrandomänen und ein Bestandteil des γ-Sekretase Komplexes. Ebenso wie die ß- Sekretase ist die gamma-Sekretase an der Spaltung des Aß-Peptids aus dem Vorläuferprotein APP beteiligt. Die Spaltung von Aß erfolgt hierbei initial durch die ß-Sekretase und anschließend intermembranär durch den gamma-Sekretase Komplex. Presenilin 1 wirkt hierbei im katalytischen Zentrum des Komplexes als Protease. Weitere Bestandteile des Komplexes sind Nicastrin, Pen-2 und APH-1. Diese Komponenten sind ebenfalls für die gamma-Sekretase Aktivität essentiell, wobei sie als Co-Faktoren eine wichtige Rolle bei der Bildung des Multiproteinkomplexes erfüllen. Das Ausschalten einer dieser Faktoren führt zum Aktivitätsverlust. Wie Presenilin 1 FAD Mutationen zu einer gesteigerten Aß Produktion und einem frühen Beginn der Alzheimer Erkrankung führen ist unbekannt. Interessenterweise sind alle bekannten FAD Mutation in den transmembranären Regionen lokalisiert. Zwischen den Transmembrandomänen 6 und 7 existiert ein großer hydrophiler Loop, der endoproteolytisch gespalten wird. Ebenfalls lokalisiert ist hier eine Caspase 3 Erkennungssequenz. Die Spaltung von Presenilin 1 durch Caspase 3 resultiert in der Bildung eines C-terminalen Fragments. Eine Rolle für Presenilin im Rahmen des apoptotischen Zelltods ist daher annehmbar. So wurde postuliert, dass das resultierende C-terminale Fragment von PS1 (PSCas) eine Rolle während der apoptotischen Signaltransduktion haben könnte. Ebenfalls wurde gezeigt, dass FAD mutiertes PS1 zu einer erhöhten Vulnerabilität führen kann. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde daher untersucht, ob Presenilin 1 einen Einfluss auf die Zellvulnerabilität und die apoptotischen Zelltodkaskasde ausübt. Ebenfalls wurde eine mögliche Rolle des PSCas Fragments untersucht. Hierzu wurde ausgehend von einem Presenilin 1 Plasmid ein PSCas Konstrukt hergestellt. Ein weiteres Konstrukt wurde erzeugt, indem Presenilin 1 an der Caspase 3 Erkennungssequenz mutiert wurde, was die Spaltung von PS1 durch Caspase 3 verhindert (PSMut). Die Transfektionsversuche in stabil transfizierten PC12 und transient transfizierten Jurkat Zellen ergaben, dass die Überexpression von Presenilin 1 eine antiapoptotische Wirkung bewirkt. Sowohl bei dem durch oxidativen Stress induzierten Zelltod, als auch bei der Induktion von Apoptose mit Fas-Ligand zeigten Zellen mit der Presenilin 1 Überexpression eine geringere Vulnerabilität im Vergleich zu Vektor- transfizierten Kontrollen. In Anbetracht der aktuellen Forschungsergebnisse, die auf eine Rolle von PSCas in der Regulation der Apoptose hindeuteten, war die Annahme zu Beginn dieser Arbeit, dass die antiapoptotische Wirkung des Presenilin 1 auf das PSCas Fragment zurückzuführen ist. Wie die Ergebnisse der PSCas Überexpression zeigen, scheint dies auch der Fall zu sein. Ähnlich der Überexpression von Presenilin 1 führt die alleinige Überexpression von PSCas zu einer reduzierten Zellvulnerabilität im Vergleich zu Vektor- transfizierten Kontrollen. In der Annahme, dass die Spaltung von Presenilin 1 hier eine regulatorische Funktion besitzten würde, erwartete man bei der Überexpression von PSMut eine Aufhebung der antiapoptotischen Wirkung. Wie sich jedoch herausstellte, führt auch die Überexpression von Presenilin 1 mit mutierter Caspase 3 Erkennungssequenz zu einer verminderten Zellvulnerabilität. Dies deutet darauf hin, dass die antiapoptotische Wirkung von Presenilin 1 auf den C-terminalen Bereich des Proteins zurückzuführen ist, hierfür aber keine Spaltung durch Caspase 3 notwendig ist. Die Spaltung von Presenilin 1 durch Caspase 3 besitzt wahrscheinlich daher keine Funktion bei der Regulation der Apoptose. Eher ist hier anzunehmen, dass Presenilin 1 eines der vielen Substrate von Caspase 3 im späten Stadium der Apoptosekaskade darstellt. Basierend auf Ergebnissen, die zeigen, dass FAD mutiertes Presenilin zu einer erhöhten Zellvulnerabilität führt, könnte in der Aufhebung der antiapoptotischen Presenilin 1 Wirkung die Ursache des frühen Erkrankungsbeginns liegen