Characterization of multidrug resistance reversion in human colorectal adenocarcinoma cell lines

Introduction: Multidrug resistance (MDR) is a condition defined by the cross-resistance to several non-structurally related drugs, representing one of the major setbacks to the success of chemotherapy. One of the best studied MDR mechanisms is the overexpression of efflux pumps, such as P-glycoprotein (Pgp), multiple resistance-related protein 1 (MRP-1) and major vault protein (LRP). These proteins confer resistance to a large spectrum of similar substrates, despite their different extrusion mechanisms. Pharmacologic inhibition of MDR transporters is the major strategy to overcome this phenotype. Verapamil is an L-type calcium-channel blocker and a modulator for Pgp and MRP-1. L-buthionine-sulfoximine (BSO) is a γ-glutamylcysteine synthase inhibitor and can be used to functionally decrease MRP-1 activity. Aim: In this study we aim to compare transport kinetics for human colorectal adenocarcinoma cell lines, one sensitive and another resistant to chemotherapy, in the presence and absence of MDR reversers, using 99mTc-Sestamibi. Methods: MDR proteins expression was evaluated in sensitive (WiDr) and resistant (LS1034) human colorectal adenocarcinoma cell lines. Intracellular and plasma membrane Pgp and MRP1, and LRP expression was analyzed by flow-cytometry; Pgp expression was also analyzed by western blot. Cellular transport kinetics was analyzed in the presence and absence of MDR modulators, verapamil and BSO, using 99mTc-Sestamibi. Uptake and retention studies were performed using sensitive and resistant cells. MDR modulation was evaluated by performing retention studies in resistant cells after incubation with the referred drugs, for different time intervals (10 and 60 minutes) and concentrations (10, 25, 50 and 100 µM). Results: Pgp and MRP-1 expression was significantly higher (p<0.05) in resistant cells when comparing with the sensitive ones, although LRP was also expressed. Western blot studies confirmed flow-cytometry results. 99mTc-Sestamibi uptake and retention percentage were significantly higher (p<0.05) in the sensitive cell line, comparing with the resistant one for all time-points considered. In resistant cells incubated with MDR modulators there were no statistically significant differences (p>0.05) when considering the curves as a whole. However, for the first minutes after incubation with 99mTc-Sestamibi, there were differences among the MDR modulators used. Conclusions: In vitro kinetic studies using 99mTc-Sestamibi could be an indicator of MDR phenotype in colorectal adenocarcinoma cells. As the modulators used showed a reversion of the retention profile only for the first minutes, their administration should occur immediately before the administration of cytotoxic drugs.Introdução: A multirresistência a fármacos (MDR) é definida pela resistência cruzada a diversos fármacos não relacionados estruturalmente, representando um dos principais factores de insucesso da quimioterapia. Um dos mecanismos mais estudados de MDR é a sobre-expressão de proteínas de efluxo, como a glicoproteína P (Pgp), a multiple resistance-related protein-1 (MRP-1) e a major vault protein (LRP). A inibição farmacológica dos transportadores associados a MDR é a principal estratégia investigada para superar este fenótipo. O verapamil é um bloqueador dos canais de cálcio do tipo L e um modulador da Pgp e da MRP-1. A L-butionina-sulfoximina (BSO) é um inibidor da γ-glutamilcisteina sintetase e pode ser utilizada para diminuir a actividade funcional da MRP-1. Objectivo: Neste estudo pretendemos comparar a cinética de transporte para linhas celulares de adenocarcinoma colorrectal, uma sensível (WiDr) e outra resistente (LS1034), na presença e ausência de reversores de MDR, utilizando 99mTc-Sestamibi. Métodos: A expressão de proteínas MDR foi avaliada nas duas linhas celulares referidas. A expressão de Pgp e MRP-1 intracelular e membranar, e a expressão de LRP foram analisadas por citometria de fluxo; a expressão de Pgp foi também analisada por western blot. A cinética de transporte foi analisada na presença e ausência dos moduladores de MDR verapamil e BSO, usando 99mTc-Sestamibi. Foram efectuados estudos de captação e retenção utilizando células sensíveis e resistentes. A modulação de MDR foi avaliada pela realização de estudos de retenção em células resistentes após a incubação com os fármacos referidos, durante diferentes intervalos de tempo (10 e 60 minutos) e concentrações (10, 25, 50 e 100 µM). Resultados: A expressão de Pgp e MRP-1 foi significativamente superior (p<0,05) nas células resistentes, embora a LRP também estivesse expressa. Os estudos de western blot confirmaram os resultados da citometria de fluxo. A captação e retenção de 99mTc-Sestamibi foram significativamente superiores (p<0,05) na linha celular sensível para todos os tempos de amostra considerados. Nas células resistentes incubadas com moduladores de MDR não houve diferenças estatisticamente significativas (p>0,05) quando se consideraram as curvas como um todo. No entanto, para os primeiros minutos após a incubação com 99mTc-Sestamibi, houve diferenças entre as células incubadas com os moduladores. Conclusões: Estudos cinéticos in vitro com 99mTc-sestamibi podem ser um indicador de fenótipo MDR em células de adenocarcinoma colorrectal. Como os moduladores usados apenas mostraram reversão do perfil de retenção para os primeiros minutos, a sua administração deverá ser feita imediatamente antes da administração de citotóxicos