The conundrum of pre-eclampsia : from candidate genes to complement system

The human pregnancy is a unique immunological process. The foetus is tolerated and nourished through the complex yet transient organ, placenta, which bears the genetic fingerprint of the developing baby. Human placentation involves several waves of invasion, whereby the placenta is deeply attached to layers of the uterine wall, through the mucosal lining of the uterus, the decidua and into the underlying muscle, the myometrium. In order for adequate but not inappropriate depth of placentation to occur, the maternal immune system must be fine-tuned to tolerate yet control the invasive trophoblast cells, which originate in the placenta. Pre-eclampsia is a common vascular disease of the human pregnancy. Pre-eclampsia, particularly in its severe form, is intrinsically linked to failure of deep-placentation. While pre-eclampsia has long been known to have a familial, i.e. genetic component, the genes contributing to the disease have not been well characterised thus far. This thesis addresses the question of role of the complement system in pre-eclampsia by comparing pre-eclamptic women to non-pre-eclamptic controls using several methods. Using immunofluorescence and immunohistochemistry, placental tissues were stained for one angiogenic receptor and nine components of the complement system to determine the localisation and extent of complement activation, and on the other hand, complement regulation in placentae from pre-eclamptic and healthy pregnancies. In two candidate gene studies, the variants within coding regions and flanking sequences surrounding exons of a key complement regulator, membrane cofactor-protein (CD46) gene (MCP/CD46) and activator, complement component 3 gene (C3) were explored in women with a history of severe pre-eclampsia and non-pre-eclamptic controls. Finally, using a targeted exomic sequencing approach we studied known candidate genes in pre-eclampsia to identify low-frequency variants in the Finnish population that may predispose to or protect from pre-eclampsia. We combined pre-eclamptic patients from the FINNPEC (Finnish genetics of pre-eclampsia consortium) and the national FINRISK studies to characterise health consequences of the most important variants that associate to pre-eclampsia. While we did not find a genetic association to pre-eclampsia in the membrane bound complement regulator, MCP, we found three out of forty-three observed single nucleotide polymorphisms to be associated with pre-eclampsia in the C3. Furthermore, a section of tight linkage disequilibrium was identified within the C3 that depending on the sequence context, may predispose to, or protect from pre-eclampsia. Most recently, the first maternal genetic association of the fms related tyrosine kinase 1 gene (FLT1) coding for an anti-angiogenetic marker soluble fms-like tyrosine kinase 1 elevated in pre-eclampsia was discovered. Two SNPs within the FLT1 protect women from not only pre-eclampsia, but also from heart failure in later life. The work presented in this thesis sheds light to some of the many inherited traits that contribute to the aetiology of pre-eclampsia. The results present a first genetic association to pre-eclampsia in C3 and they may provide a maternal genetic link between angiogenesis process during pregnancy and heart failure in later life. The crucial effect of the complement system for the successful pregnancy is demonstrated by genetic association as well as comparative localisation of complement components on the pre-eclamptic and healthy placenta tissue.Raskausaika on ainutlaatuinen immunologinen tapahtuma ihmisen elinkierrossa. Sikiötä ravitsee monimutkainen mutta väliaikainen elin, istukka, joka edustaa perimältään sikiön geneettistä sormenjälkeä. Istukan tehtävä on myös ylläpitää toleranssia äidin immuunipuolustuksessa lapsen kudosten suojelemiseksi. Ihmisen plasentaatiossa toistuvat istukkasolujen invaasioprosessit varmistavat, että elin kiinnittyy äidin kohdunseinämään limakalvokerrosten alle aina kohdunalaiseen lihaskudokseen asti. Jotta istukan kiinnittyminen ulottuu oikealle tasolle, äidin immuunipuolustuksen pitää olla virittynyt siten, että istukan invasoivia trofoblastisoluja siedetään ja kontrolloidaan samanaikaisesti. Pre-eklampsia on yleinen monitekijäinen raskaudenaikainen verisuonisairaus. Etenkin vaikea pre-eklampsia liittyy keskeisesti syväplasentaation ilmiöön. Pre-eklampsian tiedetään esiintyvän suvuittain, joten perintötekijöillä on tärkeä osa taudin puhkeamisessa, mutta suurinta osaa pre-eklampsialle altistavista geeneistä ei vielä tunneta. Väitöskirjassani käsittelen useaa menetelmää hyödyntäen luontaisen immunipuolustuksen komplementtijärjestelmän merkitystä pre-eklampsiataudissa vertailemalla pre-eklamptikkoäitejä ja äitejä, joilla ei ole ollut pre-eklampsiadiagnosia. Istukkakudosleikkeitä värjättiin immunofluoresenssi ja immunohistokemiallisin menetelmin yhtä angiogeneettistä reseptoria ja yhdeksää komplementtitekijää tunnistavilla vasta-aineilla komplementtiaktivaation ja -regulaation sijainnin ja laajuuden tutkimiseksi istukkakudoksessa. Kahdessa kandidaattigeenitutkimuksessa kuvattiin koodaavien alueiden ja niitä ympäröivien geenialueiden perimänvaihtelua keskeisessä komplementin säätelijässä MCP/CD46 ja toisaalta aktivaattorissa C3. Hyödyntämällä kohdennettua eksomisekvensointimenetelmää tutkimme myös muita tunnettuja kandidaattigeenejä pre-eklampsiataudissa tunnistaaksemme harvinaisia perimänvaihtelun muotoja suomalaisessa väestössä, jotka liittyvät pre-eklampsiatautiin. Yhdistimme FINNPEC (Finnish genetics of pre-eclampsia consortium) aineistoon ja FINRISKI-tutkimukseen kirjattujen potilaiden tietoja kuvataksemme pre-eklampsiaan liittyvien perimänvaihteluiden yhteyttä sairastavuuteen taudin jälkeen. MCP-geenistä ei löydetty pre-eklampsiaan liittyviä perimänvaihtelun muotoja, mutta C3-geenissä kuvatuista pistemutaatiosta kolmen todettiin liittyvän pre-eklampsiaan. Lisäksi C3-geenin keskivaiheilla kuvattiin sekvenssialue, jossa on vahva kytkentäepätasapaino. Riippuen alueen emäsjärjestyksestä, sen todettiin jokoaltistavan tai suojaavan pre-eklampsiataudilta. Viimeisimpänä kuvattiin ensimmäistä kertaa äidin perinnöllinen suojaava tekijä FLT1-geenistä, joka koodaa verisuonien muodostukseen liittyvää tekijää sFlt-1, jonka lisääntyneen määrän verenkierrossa tiedetään liittyvän pre-eklampsiariskiin. Kahden pistemutaation FLT1-geenissä todettiin suojaavan paitsi pre-eklampsialta, myös sydämen vajaatoiminnalta. Väitöskirjassani esittelemä tutkimus lisää ymmärrystä monista perintötekijöistä, jotka liittyvät pre-eklampsiataudin kehittymiseen. Tuloksissa kuvataan ensimmäistä kertaa perinnöllinen yhteys pre-eklampsiataudin ja C3 geenin välillä. Toisaalta äidin verisuontenmuodostusta säätelevän tekijän osalta osoitetaan perinnöllinen yhteys raskaudenaikaisenterveyden ja vähentyneen sydämen vajaatoimintaan sairastuvuuden välillä. Komplementtijärjestelmän keskeinen merkitys terveessä raskaudessa käy ilmi sekä perintötekijöiden kautta että kudosvärjäystutkimuksen keinoin pre-eklampsiaraskauksien ja terveiden raskauksien istukoita vertailemalla