Identifizierung und Charakterisierung von Leucin-reichen Repeat (LRR) Proteinen von Listeria monocytogenes EGD-e und deren Regulation

In der vorliegenden Arbeit wurden neue Leucin-reiche Repeat (LRR) Proteine des humanpathogenen Bakteriums Listeria monocytogenes identifiziert und unter Anwendung molekularbiologischer, zellbiologischer und infektiologischer Methoden näher charakterisiert (Teil I). Weiterhin wurde die Transkriptionsregulation des an der Invasion beteiligten Internalin-Operons, bestehend aus den LRR-Proteinen InlA und InlB, durch die Herstellung gezielter chromosomaler Deletionsmutanten molekularbiologisch genauer analysiert (Teil II). Die neu identifizierten LRR-Proteine InlF, InlD und InlE besitzen jeweils eine Länge von 1473 bp (490aa), 1647 bp (548aa) und 1500 bp (499aa) und sind physikalisch auf dem listeriellen Genom miteinander verbunden. Nach jedem der drei Gene ist ein Transkriptionsterminator zu finden, sodaß die Gene monocistronisch transkribiert werden. Flankiert werden die Gene inlFDE von den sogenannten Haushaltsgenen 6-Phospho-b-Glukosidase (ascB) und einer Succinyl-Diaminopimelat-Desuccinylase (dapE). Ein weiteres LRR-Protein, InlG, wurde, angelehnt an die Sequenz des Genes aus einem anderen L. monocytogenes-Stamm, ebenfalls kloniert. Es konnten keine Sequenzunterschiede zu dem in dieser Arbeit verwendeten Stamm EGD-e gefunden werden. L. innocua ist mit L. monocytogenes sehr eng verwandt und unterscheidet sich vor allem durch das Fehlen der bekannten Pathogenitätsfaktoren Hly, PlcA/B, Mpl, ActA, InlA/B, IrpA und deren Transkriptionsregulator PrfA. Durch eine spezifische PCR mit Oligonukleotiden, die in den flankierenden Genen ascB und dapE binden, konnte gezeigt werden, dass das inlFDE-Gencluster in L. innocua nicht vorhanden ist. Somit handelt es sich bei diesem Gencluster um eine weitere, neu entdeckte L. monocytogenes-spezifische Determinante. Durch Analyse der Aminosäuresequenzen der Genprodukte InlFDE konnte gezeigt werden, dass die drei Proteine der Familie der LRR-Proteine von L. monocytogenes zuzuordnen sind. Sie besitzen ebenfalls ein N-terminales Signalpeptid, eine ca. 50 bp große Spacer-Region, eine unterschiedliche Anzahl Leucin-reicher Repeats (InlF = 6; InlD und InlE = 8¾) von in der Regel jeweils 22 Aminosäuren Länge, eine zweite Repeat-Region und einen C-terminalen Membrananker. Die transkriptionelle Regulation der Gene inlFDE und InlG wurde mittels Transkriptionsstudien untersucht. In Northernblot-Analysen konnte gezeigt werden, dass nur bei InlD eine monocistronische mRNA vorhanden ist. Die Gene inlFE und InlG wurden unter den angewandten experimentellen Bedingungen nicht transkribiert. Es konnte auch gezeigt werden, dass die Regulation des InlD-Gens Temperatur-unabhängig erfolgt: Ein Transkript wurde bei 4°C, 20°C und 37°C in gleicher Menge nachgewiesen. Die durch diese Analysen erzielten Ergebnisse konnten durch Reportergenanalysen bestätigt werden. Hierzu wurden die 5‘-Sequenzen mit den putativen Promotoren der Gene inlFDE und inlG in einen Vektor mit dem Beta-Glukosidasegen aus Bacillus stearothermophilus als eine Transkriptionsfusion kloniert und in rekombinanten L. monocytogenes untersucht. In der Tat konnte auch hier nur bei dem Konstrukt mit dem inlD-Promotor eine Beta-Glukosidase-Aktivität nachgewiesen werden. Um einen möglichen Beitrag der Genprodukte InlFDE zur Pathogenität und/oder Virulenz von L. monocytogenes zu zeigen, wurden stabile chromosomale Deletionsmutanten ohne polare Effekte in L. monocytogenes EGD-e hergestellt. Es wurden sowohl die einzelnen Gene inlF, inlD, inlE als auch das gesamte Gencluster inlFDE deletiert und die isogenen Deletionsmutanten in Zellkulturversuchen und im Mausinfektionsmodell untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Gene inlFDE nicht an der Invasion von Caco-2 und HeLa Zellen beteiligt sind. Der Infektionszyklus in diesen Wirtszellen unterscheidet sich auch nicht zum Wildtyp, was durch Immunfluoreszenzfärbungen gezeigt werden konnte. Allerdings konnte eine Auswirkung der Deletion des inlD-Gens in Mäusen gezeigt werden. Nach intravenöser Applikation der inlD-Mutanten wurden diese Bakterien in Leber und Milz der infizierten Mäuse in signifikant geringeren Mengen im Vergleich zum Wildtyp gefunden. Dies bedeutet, dass zumindest dem InlD-Genprodukt eine Rolle in der Pathogenität von L. monocytogenes (in vivo) zuzuordnen ist. Für Proteinanalysen wurden die Gene inlF/D/E im Gluthation S-Transferase System rekombinant gereinigt. Mit den gereinigten Proteinen wurden Kanincheseren hergestellt und für immunbiochemische Nachweise von Überstands- und Zellwandproteinen aus L. monocytogenes EGD-e eingesetzt. Im Rahmen des Genomprojektes zur Sequenzierung und Kartierung des Genoms von L. monocytogenes EGD-e am Institut für Medizinische Mikrobiologie in Gießen wurden in bekannten Pathogenitätsfaktoren auf dem Genom Deletionen mit einer NotI-Restriktionsschnittstelle hergestellt. Diese Mutanten wurden zur NotI-Kartierung von L. monocytogenes EGD-e verwendet und ermöglichten eine Sequenz-unabhängige Lokalisation der Pathogenitätsfaktoren auf dem Genom des Bakteriums. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit sollte die Regulation des inlAB-Operons, die PrfA- abhängig und PrfA-unabhängig erfolgt, genauer untersucht werden. Hierzu wurde die prfA-Box vor den Genen inlAB zum einen chromosomal deletiert und zum anderen durch eine gleich lange, nicht identische Sequenz chromosomal substituiert. Durch immunbiochemische Analysen und Northernblot-Studien konnte gezeigt werden, dass die Gene inlAB beim Wildtyp EGD-e und bei der Deletionsmutante DprfA2 in gleichem Maße transkribiert und translatiert werden, während bei den Mutanten mit der prfA-Box-Deletion und -Substitution nur sehr geringe Mengen an Transkript und Protein vorhanden waren. Diese Ergebnisse deuten eindeutig darauf hin, dass es einen von PrfA unabhängigen Transkriptionsregulator des inlAB-Operons geben muss. In Zellkulturversuchen mit Caco-2 und HeLa Zellen konnte gezeigt werden, dass Stämme, die in ihrer vor dem inlAB-Operon liegenden PrfA-Box mutiert sind, genau wie Stämme mit einer Deletion im inlAB-Operon, nicht invadieren