Protein engineering of esterases: climbing the protein fitness landscape

Luis da Silva Godinho beschrijft in zijn proefschrift hoe esterases afkomstig vanBacillus subtilisenEscherichia coligebruikt kunnen worden voor de synthese van een zuiver chiraal synthon; hetgeen van groot belang is voor de farmaceutische industrie. De ontwikkeling van een enzymatisch proces voor de kinetische resolutie van racemische 1,2-O-isopropylideneglycerol (IPG) esters is een van de grote uitdagingen in de biokatalyse. Het ideale enzym zal slechts de R-enantiomeer van de IPG ester hydrolyseren, resulterend in het optisch zuivere product (S)-IPG. Dit is een belangrijk chiraal synthon voor de vervaardiging van vele biologisch actieve verbindingen, zoals fosfolipiden enβ-adrenoceptor antagonisten. Esterases zijn zeer geschikt als biokatalysator dankzij een aantal aantrekkelijke eigenschappen, zoals een brede substraatspecificiteit, hoge stabiliteit, hoge enantioselectiviteit en de afwezigheid van cofactoren. Tijdens zijn onderzoek ontdekte Da Silva Godinho bij toeval het enzym YbfF, afkomstig van de bacterieE. coli. Dit enzym vertoont een hoge hydrolytische activiteit op IPG esters met de gezochte enantioselectiviteit. De eigenschappen van YbfF en het gebruik voor de synthese van (S)-IPG beschrijft hij in zijn proefschrift. ‘Protein engineering’ technieken, zoals het rationeel ontwerp of de gerichte evolutie van eiwitten, hebben het mogelijk gemaakt enzymen te verbeteren voor belangrijke praktische toepassingen. Da Silva Godinho creëerde nieuwe varianten van hetB. subtilusCesA esterase, die een verhoogde enantioselectiviteit vertonen in de resolutie van IPG-esters. Het ontwerp van deze nieuwe CesA varianten was geïnspireerd op een nauwgezette vergelijking met de substraatbindingsplaats van het verwante esterase CesB. Ook van het esterase YbfF zijn door hem verbeterde varianten geconstrueerd. In zijn proefschrift worden kinetische studies en ‘molecular docking’ experimenten beschreven die ons begrip voor de structuur-functie relatie van esterases en in het bijzonder de enantioselectiviteit sterk verbeteren. The thesis of Luis da Silva Godinho describes the application of esterases originated from B. subtilis and E. coli species for the enantiopure production of a chiral synthon of great interest for the pharmaceutical industry. The goal was to develop a biocatalytic process for the kinetic resolution of racemic 1,2-O-isopropylideneglycerol (IPG) esters. In the ideal case, a biocatalyst converts only the R-enantiomer of the substrate, yielding the optically pure product (S)-IPG, which is an important chiral synthon in the synthesis of many biologically active compounds, such as phospholipids and β-adrenoceptor antagonists. Esterases are of great interest due to their favorable properties in terms of broad substrate acceptance, high stability, enantioselectivity, and the fact that they do not require cofactors for activity, that make them attractive biocatalysts for use in organic synthesis. During his project, it was discovered by Da Silva Godinho that an enzyme from E.coli, YbfF, exhibits hydrolytic activity towards IPG esters with significant enantiopreference towards the substrate of interest. Protein engineering techniques, such as rational design and directed evolution, allowed in the past years the creation of new enzymes with important practical applications. To enhance the enantioselectivity of wild type enzymes in the resolution of IPG esters, two strategies were applied: structure comparison with a homologous esterase and structure-substrate interaction analysis. The identification and characterization of novel esterase variants with enhanced enantioselectivity in the resolution of IPG esters were reported. Kinetic studies and molecular docking experiments were performed in order to increase our understanding of structure-function relationship for altering esterase enantioselectivity.