The role of telomerase on cell proliferation in zebrafish (Danio rerio)

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010Os telómeros são as extremidades dos cromossomas lineares dos organismos eucarióticos. São regiões de cromatina com propriedades específicas, conferidas pela estrutura do seu ADN e pelas proteínas que a ele estão associadas. Em vertebrados, o ADN telomérico é constituído pela sequência TTAGGG, repetida lado-a-lado um número variável de vezes. Para além de uma região extensa em cadeia dupla, a parte terminal dos telómeros contém uma extermidade projectada a 3’, rica em guanosinas, e as proteínas teloméricas estão associadas de forma específica a cada uma destas regiões. Estas estruturas são essenciais para a manutenção da integridade do genoma, já que conferem protecção face à acção de exonucleases e à acção de enzimas de reparação de danos no ADN. Impedem também a perda de informação genética com a ocorrência da replicação, algo que está relacionado com o ‘problema da replicação terminal’. Devido à incapacidade de as polimerases de ADN polimerisarem nucleótidos na ausência de um ‘primer’, é impossível sintetizar a parte final da cadeia descontínua durante a replicação de moléculas lineares. Isto levaria a que a cadeia de ADN encurtasse, com cada ciclo replicativo, o que conduziria à perda progressiva de informação genética. Os telómeros, sendo estruturas não-génicas, impedem que tal aconteça. Sabe-se que os telómeros encurtam devido não só ao problema da replicação terminal mas também à ressecção adicional, regulada, que dá origem à extremidade 3’ projectada. Para que tal não aconteça, as células apresentam mecanismos para alongar os telómeros que podem ser baseados em recombinação entre telómeros (chamados de Alternative Lengthening Mechanisms ou ALT) ou na acção da telomerase. A telomerase é constituída por uma componente proteica com actividade de transcritase reversa (Tert) e uma componente de ARN (Terc). Esta nucleoproteína, bastante conservada entre os eucariotas, sintetiza repetições teloméricas a partir do molde que se encontra na componente de ARN, alongando telómeros curtos. A sua produção e actividade são controlados pelas proteínas e demais constituintes dos telómeros e a sua acção depende do estado celular. No Homem, a maioria das células somáticas não a expressa e existe uma correlação entre o tamanho dos telómeros e a idade, sendo os telómeros de pessoas de maior idade mais curtos do que os de pessoas mais jovens. A telomerase é expressa nas células da linha germinal, permitindo a manutenção do comprimento dos telómeros e a transmissão do genoma estável à próxima geração. Esta é também expressa nas células proliferativas de nichos de células estaminais em níveis que não são, porém, suficientes para impedir o encurtamento dos telómeros. As células somáticas não podem ser propagadas em cultura indefinidamente. Sabe-se que em cultura dividem um limitado número de vezes após o qual entram num estado de senescência. Este ‘limite de Hayflick’ está relacionado com o facto de os telómeros encurtarem com cada divisão celular. Os telómeros criticamente curtos conduzem à activação de ‘checkpoints’ dependentes de P53 e outros supressores de tumores, de modo a impedir a progressão do ciclo celular. Deste modo, as células sofrem uma série de alterações que caracterizam a senescência celular ou entram num processo apoptótico. Se tal não acontece, desencadeia-se uma resposta de reparação de danos no ADN, o que leva a instabilidade cromossómica, com a ocorrência de ciclos de fusões entre cromossomas e quebras no ADN e, em último caso, contribui para o surgimento de tumores. É possível encontrar células senescentes em tecidos. Dado que a maioria das células somáticas não expressa telomerase é possível que o declínio na manutenção do funcionamento dos órgãos e funções biológicas, característico do processo do envelhecimento, esteja relacionado com a incapacidade de proliferação causada pelo encurtamento dos telómeros. Existem algumas doenças humanas que se manifestam em problemas na manutenção dos tecidos, envelhecimento precoce e tempo de vida diminuído. Uma destas doenças, a Disqueratose Congénita, é causada por mutações em componentes da telomerase, o que apoia o papel do encurtamento dos telómeros no processo do envelhecimento, juntamente com o facto de algumas variantes da proteína Tert estarem relacionadas com maior longevidade. Longevidade é o tempo em que é possível a um organismo manter as funções celulares, prevenindo alterações associadas com o envelhecimento. Apesar de o papel dos telómeros na senescência celular ser já reconhecido como importante, o seu papel no envelhecimento e longevidade permanece em investigação. Estudos em ratinho, com vista a compreender o papel dos telómeros nestes processos, mostraram que a ausência da telomerase causa fenótipos de envelhecimento, como a degeneração de tecidos proliferativos, infertilidade e incapacidade de cicatrização de feridas, acompanhados de alterações citogenéticas de fusões e aneuploidias. No entanto, o ratinho apresenta várias características específicas que o afastam da realidade no Homem. São precisas gerações de cruzamentos entre ratinhos knock out, em que os seus telómeros são artificialmente encurtados a um ponto crítico, para que surjam fenótipos. Assim, o eixo telómeros/telomerase não parece ser fundamental para o controlo da proliferação celular e manutenção dos tecidos, ao contrário do que parece acontecer em humanos. O peixe-zebra (Danio rerio) tem sido apresentado como um novo modelo de envelhecimento, e neste âmbito, poderá ser um bom modelo vertebrado alternativo para estudar o papel dos telómeros e da telomerase na proliferação celular e homeostasia de tecidos com o envelhecimento. Este modelo possui várias vantagens específicas: é fácil e barato de manter, o que permite seguir muitos indivíduos; envelhece gradualmente e manifesta características semelhantes às dos humanos; expressa vários marcadores celulares de senescência que permitem a procura de genes relacionados com o envelhecimento em larga escala; e é um modelo de excelência para manipulação genética e criação de transgénicos para microscopia em tempo real. O peixe tem a capacidade de regenerar quase todos os seus órgãos, ao contrário dos humanos, num processo que depende altamente de proliferação celular, e a expressão da telomerase tem sido apontada como uma das características necessárias para que tal aconteça. Tem também telómeros mais curtos que o ratinho, menor actividade da telomerase e várias observações apontam para um papel da manutenção dos telómeros na proliferação celular e sua implicação no processo de envelhecimento do peixe-zebra. Neste contexto, pretendeu-se caracterizar um mutante em peixe-zebra, em que a actividade da telomerase foi abolida (terthu3430). Determinou-se o tamanho médio dos telómeros de mutantes, em comparação com indivíduos selvagens, através da técnica de restrição dos fragmentos terminais seguida de hibridação Southern. O peixe-zebra parece ter, de facto, telómeros curtos, de cerca de 7 Kb, e o mutante apresenta logo aos 6 meses de idade uma diminuição significativa do tamanho dos telómeros no tecido da barbatana caudal, que não é especialmente proliferativo. Isto indica que a telomerase pode ser um mecanismo fundamental para a manutenção dos telómeros neste organismo. Os fenótipos apresentados são consistentes com um papel da telomerase e dos telómeros na proliferação celular e manutenção dos tecidos proliferativos do adulto (intestino, retina, músculo esquelético, brânquias, intestino e gónadas) com o tempo. Uma das primeiras consequências, associada à degeneração das gónadas, é a infertilidade dos machos e, mais tarde, das fêmeas. Embriões homozigóticos mutantes sem contribuição maternal são inviáveis, e apresentam fenótipos variados consistentes com problemas na proliferação celular e/ou apoptose. Assim, a telomerase parece ser fundamental em vários fenómenos que dependem da proliferação celular, em peixe-zebra. Estes resultados aproximam-se da realidade em humanos, e apoiam a utilização do peixe-zebra como modelo vertebrado alternativo para compreender qual o papel dos telómeros no processo de envelhecimento, determinação de longevidade, e também para modelação do papel dos telómeros e da telomerase no cancro e no processo regenerativo.Telomeres, the tips of linear eukaryotic chromosomes, are responsible for protecting chromosome ends from exonucleases and DNA repair events. Together with the enzyme telomerase, they provide a way to elongate telomeres, preventing loss of genetic information with replication due to the end-replication problem and to additional resection of the 5’ end. The progressive shortening of telomeres in the absence of telomerase, or other recombination-based mechanisms, leads to cellular senescence and it is hypothesized that this could be responsible for organismal ageing. Zebrafish has been proposed as a promising vertebrate ageing model. It ages gradually and display many cellular features common to human senescence. It is currently used for the study of age-dependent changes in various organs, such as the muscle, skeleton and the eye. In contrast to inbred mice, they possess shorter telomeres of the same length of humans (5-10kb), which suggests similar mechanisms in the regulation of cell proliferation by telomeres. An early nonsense mutation in telomerase component gene tert (terthu3430) results in fish that exhibit shorter telomeres observable by 6 months of age. This points telomerase as a fundamental mechanism for telomere maintenance in this organism, in contrast to inbred mice models. The phenotypes are consistent with a role of telomerase in cell proliferation and tissue maintenance in the adult, with impaired organ renewal and function leading to infertility and a decline in health status and precocious death by 1 year of age. A role for telomerase on cell proliferation is also evident on the developmental defects of maternal zygotic mutant embryos that make them unviable. These results support the use of zebrafish as an alternative animal model for the role of telomeres and telomerase on cell proliferation events like development and regeneration, and tissue turn-over degeneration, which occurs during the ageing process