Design synthesis and biological evaluation of new antiplasmodial compounds related to ellagic acid

Trabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2017Malaria remains a major public health problem, especially in subtropical regions. This endemic disease is caused by parasitic protozoans that belong to the Plasmodium type and people who get malaria are typically very sick with high fevers, shaking chills, and flu-like symptoms. Approximately 3.2 billion people worldwide are at risk of being infected and develop this disease. The highest risk is in the sub-Saharan Africa region where approximately 80 % of cases and 90 % of deaths occurs, mostly in children under five years and in pregnant women. The rise and spread of the resistance of Plasmodium falciparum malaria to chloroquine, sulfadoxine-pyrimethamine and artemisinin as well as the resistance of P. falciparum malaria vectors to pyrethroids (insecticides used to prevent malaria in endemic regions), presents a serious challenge, especially in developing countries. Therefore it is imperative and crucial the design of new antimalarial drugs. Medicinal plants constitute a promising source of new drugs and there is now a real worldwide interest in antiplasmodial plants. Ellagic acid is a polyphenol found in various plant products, whose main biological activities include antioxidant, anticarcinogenic, antimicrobial, anti-inflammatory and antiplasmodial effect. This compound has an in vitro IC50 between 100 and 300 nM against several Plasmodium falciparum strains, whatever the level of resistance against chloroquine and mefloquine, and it shows no toxicity on human cells at 100 µM. It has also prophylactic properties throughout in vivo studies, synergistic activities with chloroquine, mefloquine, artesunate and atovaquone, and it acts at the late stage of the erythrocytic life cycle. This natural compound has also in vivo activity against Plasmodium, thanks to parenteral administration, but modification of the compound could lead to improved pharmacological properties, principally for the oral route because this molecule suffers of a poor oral bioavailability. In this research work, the main objective was to develop new antiplasmodial compounds derived from the structure of ellagic acid and showing improved pharmacokinetic parameters compared to the parent compound. These new compounds should constitute a set of powerful drug candidates for the treatment of malaria, when its antimalarial activity in vitro should be evaluated.Actualmente, a malária continua a ser uma das maiores ameaças à vida humana em termos de problemas de saúde pública a nível mundial. Estima-se que cerca de 3,2 biliões de pessoas, em 95 países e territórios, estejam em risco de infecção pelo Plasmodium e assim contrair esta doença que, por vezes, se torna fatal. Em 2015, foram registados 212 milhões de casos de malária, verificando-se ainda cerca de 429 000 mortes. A epidemia tem maior impacto no hemisfério sul, principalmente em países em desenvolvimento sendo que mais de 90% das mortes devidas à malária acontecem na zona subsariana de África. As crianças com idade inferior a 5 anos, que representam 70% das mortes registadas em África, e as grávidas constituem os grupos de maior risco no que concerne à infecção, tendo em conta o estado débil dos seus sistemas imunitários. No entanto, têm-se verificado avanços no controlo e tratamento desta doença, com a taxa de incidência a diminuir 41% no período de 2000 a 2010, e 21% entre 2010 e 2015. Este declínio no número de casos e mortes registados deve-se, em grande medida, às melhorias no acesso a cuidados de saúde incluindo o uso de terapias combinadas à base de artemisinina e ainda às grandes campanhas de prevenção e sensibilização organizadas. A infecção pelos parasitas da malária pode levar a um amplo espectro de sintomas, desde a sua ausência ou mesmo sintomas muito leves, tais como náuseas, vómitos, dores de cabeça e febre, até a uma doença com consequências graves e possivelmente fatais, como anemia grave por hemólise ou insuficiência renal aguda. A malária é, então, uma doença infecciosa transmitida por mosquitos e provocada por parasitas protozoários do género Plasmodium, cujo ciclo de vida se verifica extremamente complexo. A transmissão para humanos ocorre pela picada de uma fémea infectada do mosquito Anopheles, a qual introduz no sistema circulatório do humano os esporozoítos presentes na sua saliva, que vão posteriormente infectar os hepatócitos, onde maturam desenvolvendo esquizontes. Após a maturação dos esquizontes estas células rompem libertando na circulação merozoítos, que vão infectar os glóbulos vermelhos. Nas hemácias, ocorre a multiplicação assexuada formando um esquizonte sanguíneo cuja ruptura liberta novamente merozoítos com a capacidade de infectar novos eritrócitos. Os parasitas na fase sanguínea são os responsáveis pelas manifestações clínicas da doença, e alguns destes têm a capacidade de se diferenciar em formas eritrocíticas sexuais (gametócitos). Os gametócitos masculinos e femininos, micro e macrogametócitos respectivamente, são ingeridos pela fémea do mosquito Anopheles através de uma picada dando-se início ao ciclo esporogónico com a multiplicação dos parasitas no mosquito. Uma vez no estômago do mosquito, os microgâmetas penetram os macrogâmetas dando origem a zigotos que se tornam alongados e móveis (oocinetes) e invadem a parede do intestino onde se desenvolvem em oocistos. Estes oocistos crescem e após a sua ruptura libertam esporozoítos que através da circulação sanguínea chegam às glândulas salivares do mosquito. Quando ocorre nova picada do mosquito Anopheles num outro ser humano, os esporozoítos são inoculados conjuntamente com a saliva do mosquito e começa, então, outra infecção humana. Quanto à prevenção da malária, os seus principais objectivos são reduzir consideravelmente a transmissão do parasita, limitar a propagação da doença e, em última instância, diminuir a morbidade e a mortalidade. Existem várias estratégias de prevenção para alcançar os objectivos supramencionados, como a quimioprevenção, através de fármacos que suprimem as infecções; por controlo do vector, evitando as picadas de mosquitos em seres humanos e, eventualmente, no futuro, pela vacinação. A utilização destes métodos é essencial para evitar o aparecimento e desenvolvimento de resistências aos tratamentos já existentes. Durante o século XX ocorreram vários progressos científicos e tecnológicos no desenvolvimento de novos fármacos, onde a cloroquina e a artemisinina figuram como as descobertas mais relevantes. Contudo, o Plasmodium falciparum possui a capacidade de desenvolver resistência a estas moléculas e, assim, comprometer a eficácia continuada dos tratamentos. Este facto desperta então uma grande necessidade de novas abordagens terapêuticas, bem como o desenvolvimento de novos fármacos, de preferência com diferentes mecanismos de acção. Em resposta à propagação da resistência adquirida pelo Plasmodium à cloroquina e outros antimaláricos como a sulfadoxina e pirimetamina, as Terapias de Combinação à base de Artemisinina (TCAs) estão actualmente recomendadas para o tratamento da malária não severa, e o seu uso tem sido um factor determinante no notável decréscimo do número de casos desta doença infecciosa a nível mundial. Apesar de todos os esforços desenvolvidos nas últimas décadas, ainda não existe nenhuma vacina disponível. RTS,S/AS01, uma vacina anti-esporozoíta é, neste momento, o candidato em ensaios clínicos mais promissor. Actualmente já passou, com sucesso, os testes clínicos de fase III em mais de 15.000 crianças africanas. Durante um ano de seguimento, a vacinação com uma série de três doses, diminuiu os casos clínicos de malária em 18% em lactentes e 28% em crianças. Esta vacina, que representa grande esperança para o controlo da malária, está a ser desenvolvida pela GlaxoSmithKline (GSK) em colaboração e parceria com outras entidades. Neste trabalho o grande foco, na tentativa de encontrar melhorias para a saúde global no combate à malária, esteve num composto natural polifenólico presente em inúmeros frutos e vegetais como morangos, framboesas, nozes e romãs: o ácido elágico. A estrutura do mesmo é composta por dois anéis lactónicos e dois anéis fenílicos com dois grupos hidroxilo cada - C14H6O8. As principais actividades biológicas deste composto incluem a acção antioxidante, anticarcinogénica, antimicrobiana, anti-inflamatória e antimalárica, como reportado por vários estudos realizados. O ácido elágico possui um valor de IC50 entre 100 e 300 nM, contra várias estirpes de Plasmodium falciparum, seja qual for o seu nível de resistência contra a cloroquina e a mefloquina, e não mostra toxicidade em células humanas a 100 μM. Demostra também propriedades profilácticas, bem como uma clara sinergia com a cloroquina, mefloquina, artesunato e atovaquona, actuando na parte final da fase eritrocítica do ciclo de vida do parasita. No entanto o seu uso como fármaco in vivo encontra-se comprometido devido à sua reduzida biodisponibilidade oral. Esta desvantagem deve-se ao facto do ácido elágico apresentar uma baixa solubilidade em água bem como em outros solventes orgânicos. Esta característica pode ser explicada pela estrutura planar da molécula favorecendo a aglomeração da mesma e tornando bastante difícil a sua separaração. Vários alvos moleculares foram propostos para explicar a actividade antimalárica do ácido elágico, tais como a regulação da expressão da glutationa S-transferase (GST), a inibição da formação de β-hematina e, em menor grau, a inibição das plasmepsinas, mas o seu mecanismo de acção ainda não se encontra totalmente esclarecido. O presente trabalho visa, então, desenvolver novos compostos antimaláricos derivados da estrutura do ácido elágico na tentativa de melhorar os parâmetros farmacocinéticos relativamente ao composto original. Através da introdução de cadeias alquilo polares na estrutura do composto espera-se uma melhoria das características físicas e químicas dos derivados quando comparadas com os atributos do ácido elágico. Algumas das alterações estruturais realizadas poderiam ser também responsáveis pela obtenção de compostos com uma clara melhoria da actividade antimalárica relativamente ao ácido elágico. Dessa forma, os principais objectivos poder-se-ão dividir em três partes: 1) síntese de derivados do ácido elágico com o intuito de melhorar os seus parâmetros farmacocinéticos; 2) purificação e identificação dos compostos sintetizados; e 3) avaliação da actividade malárica desses mesmos compostos, usando um ensaio in vitro com o Plasmodium falciparum