Characterization of protective antigens from the human pathogen Streptococcus pyogenes and their contribution to virulence

Streptococcus pyogenes zählt zu Gruppe A Streptokokken und ist ein gram-positives extrazelluläres bakterielles Pathogen. Es ist fähig eine Vielzahl humaner Infektionen zu verursachen, die von asymptomatischer Kolonisierung bis hin zu lebensbedrohlichen invasiven Krankheiten reichen. Obwohl die Behandlung mit Antibiotika sehr effektiv ist, kann es im Falle einer unbehandelten S. pyogenes Infektion, zu schwerwiegenden Folgekrankheiten kommen, die zu signifikanter Morbidität und Mortalität führen können. Infektionskrankheiten sind die zweithäufigste Todesursache weltweit. Aufgrund zunehmender Antibiotikumresistenz vieler Pathogene, stellen Impfstoffe eine wichtige Alternative dar, um bestimmte Krankheiten zu heilen oder diesen sogar vorzubeugen. Darum hat Intercell’s Antigen Identifizierungprogramm (AIP) neue Proteinantigene identifiziert, basierend auf humanen Seren und `bacterial surface display`, für die Entwicklung eines prophylaktischen, antibakteriellen Vakzins, beruhend auf rekombinanten Proteinen. Aus den 9 vielversprechendsten Kandidaten, die mittels umfassender Validierungsprozeduren und Protektionsstudien in Mäusen selektiert werden konnten, wurden drei Impfstoffkandidaten, Spy0416, Spy0895 und Spy1536, näher charakterisiert, um deren Rolle in der Krankheitenentwicklung durch Gruppe A Streptokokken zu evaluieren. Spy0416, annotiert als ScpC, wurde weiters in seiner biochemischen Funktion näher analysiert. Diese Analyse ergab, dass die rekombinante Form von Spy0416 Interleukin 8, abhängig von Inkubationszeit und Enzymkonzentration, in vitro abbauen kann. Überraschenderweise zeigte die Proteinasedomäne alleine keine IL-8 abbauende Aktivität, da diese von der Anwesenheit der C-terminalen Hilfsdomänen abhängig war. Die Evaluierung einer möglichen Beteiligung der C-terminalen Domänen am IL-8 Abbau zeigte, dass keine dieser Domänen in Kombination mit der N-terminalen Proteinasedomäne IL-8 abbaut. Das deutet darauf hin, dass Spy0416 in seiner Gesamtheit essenziell für die enzymatische Aktivität in vitro ist. Mit weiteren zwei Kandidaten, Spy0895 und Spy1536, wurden Gendeletionsmutanten generiert. Während der Stamm ΔSpy0895 keinen deutlichen Phänotyp aufwies, ergab die Deletion des spy1536 Gens, dass Spy1536 eine wichtige Funktion in der Bindung an humane Proteine wie Fibrinogen, Fibronektin, Collagen I, Plasminogen und Laminin in vitro vermittelt. Die Analysen von Expression der beiden Oberflächenproteine, M Protein und Spy0269, deuteten darauf hin, dass die reduzierte Bindung von ΔSpy1536 Zellen an die humanen Plasma- und extrazellulären Matrix Proteine aufgrund einer außer Kraft gesetzten Lokalisierung dieser und möglicherweise anderer GAS Proteine auf der Oberfläche von ΔSpy1536 herrührt. Interessanterweise war das M Protein nach wie vor im Zytoplasma detektierbar, aber nicht in der bakteriellen Zellwand. Dies stimmt mit den Microarrayanalysen überein. In diesen war die Transkription von M Protein und Spy0269 kodierenden Genen nicht betroffen. Weiters bestätigten Microarray und Real Time RT-PCR den beobachteten Phänotyp der spy1536 Gendeletionsmutante. Es konnte eine 10-100 fach reduzierte Transkription von fcrA, das einen `M-related protein precursor` kodiert, von sclA und sclB gezeigt werden, welche die entsprechenden Collagen-ähnlichen Oberflächenproteine SclA und SclB kodieren, sowie eine reduzierte Transkription von sfbX49, welches das Fibronektin-bindende Protein SfbX49 kodiert. Zusätzlich wurde eine 2 fach erhöhte Transkription des hasA Gens gezeigt, das eine Hyaluronat Synthase zur Produktion der Hyaluronidase-Kapsel kodiert. Diese Arbeit hat den Hinweis erbracht, dass Spy0416 und Spy1536 an der Krankheitsentwicklung durch Gruppe A Streptokokken beteiligt sind, was deren Selektion als Impfstoffkandidaten stark unterstützt.Streptococcus pyogenes, belonging to Group A Streptococci, is a gram-positive, extracellular bacterial pathogen and can cause a wide variety of human infections that range from asymptomatic colonization to life threatening invasive diseases. Although antibiotic treatment is very effective, when left untreated S. pyogenes infections can lead to post-streptococcal sequelae and severe diseases causing significant morbidity and mortality worldwide. Infectious diseases are the second leading cause of death worldwide, and the acquisition of antibiotic resistance by many pathogenic bacteria has incited interest in generating vaccines to cure or prevent disease. Therefore, Intercell` s Antigen Identification Program (AIP) has identified novel S. pyogenes protein antigens relying on human sera and bacterial surface display for a prophylactic vaccine based on recombinant proteins. Out of the 9 most promising protein candidates, selected by a multistep validation program and protection studies in mice, three vaccine candidates, Spy0416, Spy0895 and Spy1536, were chosen to evaluate their contribution to GAS disease. Spy0416, annotated as ScpC, was further characterized for its biochemical function. This demonstrated that the recombinant form of Spy0416 is capable of IL-8 degradation in vitro in a time and concentration dependent manner. Surprisingly, the isolated predicted proteinase domain did not exhibit IL-8 degrading activity, but was dependent on the presence of its ancillary C-terminal domains. The evaluation of possible contributions of the predicted C-terminal domains to IL-8 degradation showed that none of them in combination with the N-terminal proteinase domain degraded IL-8. This indicated the Spy0416 protein is in its entirety essential for the enzymatic activity in vitro. For the two candidates Spy0895 and Spy1536 gene deletion mutants have been generated. While the ΔSpy0895 strain did not show a distinct phenotype, deletion of the spy1536 gene revealed an important role for Spy1536 to mediate binding to human proteins such as fibrinogen, fibronectin, collagen I, plasminogen and laminin in vitro. Analysis of the expression of the two surface proteins, the M protein and Spy0269, indicated that the reduced binding of ΔSpy1536 streptococcal cells to human plasma- and extracellular matrix-proteins is due to the abrogated localization of these and possibly other GAS proteins on the surface of ΔSpy1536. Interestingly, M protein was still detectable in the cytoplasm, but not in the bacterial cell wall fraction. This is in agreement with microarray analyses which revealed that transcription of the M protein and Spy0269 encoding genes was not affected. Furthermore, Microarray and Real Time RT-PCR also confirmed the observed phenotype of the spy1536 gene deletion mutant. It revealed a ~10-100 fold reduced transcription of fcrA, encoding an M-related protein precursor, of sclA and sclB, encoding collagen-like surface proteins ScIA and ScIB, as well as reduced transcription of the sfbX49 gene, encoding the fibronectin-binding protein SfbX49. Furthermore, hasA encoding hyaluronate synthase for the production of hyaluronidase capsule was found to be ~2 fold upregulated. The work has therefore provided important evidence that Spy0416 and Spy1536 contribute to GAS pathogenesis which strongly supports their selection as vaccine candidates