Determinantes imunogenéticos de susceptibilidade/resistência a infecções por Mycobacterium ulcerans: estudo populacional - banco biológico da Úlcera do Buruli no Benim

Tese de Doutoramento - Doutoramento em MedicinaBuruli ulcer (BU) is an infectious disease found in tropical regions of Africa, America, Asia, and Australia. Most of the cases are reported in West Africa and BU is considered a neglected tropical disease by the World Health Organization (WHO). This necrotising skin infection is caused by Mycobacterium ulcerans that secretes the exotoxin mycolactone as its main virulence factor. There is emerging evidence for a major role of genetic factors contributing to either BU development or disease progression. Indeed, not all individuals, even after sustained exposure to M. ulcerans in endemic wetlands, develop BU and when patients present these lesions, a wide spectrum of clinical manifestations can be observed, including non-ulcerative and ulcerative lesions. In addition, spontaneous healing of BU lesions has been previously reported, as well as clustering of cases within specific families. In that sense, it is clear that, to further evaluate the influence of host genetic variability in BU susceptibility and disease severity, new tools are needed. Therefore, we have built a bank of biological samples from a cohort of fully characterized BU patients from Benin, West Africa, as well as from a cohort of unrelated controls matched for age, gender and water contact habits. With this biological bank, the impact of several immune-related polymorphisms can be evaluated, not only for BU susceptibility or resistance, but also for differences in disease phenotypes. Since a precise BU phenotype definition is critical to proceed to any genetic study, we first planned a clinical-based study, retrospectively examining records of patients in Benin, who had laboratory confirmed M. ulcerans infection. We started by evaluating the relationship between the type of lesion presentation and the time delay to seek medical attention, defined as the time between the first remembered signs of disease and attendance for medical care. Of the 476 BU patients studied, 32% had a non-ulcerated form of skin lesion (nodule, oedema or plaque), while 67% presented ulcerated lesions. Only 1% of the patients had disease with bone involvement. In the non-ulcerated forms, the average time delay between symptoms and medical care was 32.5 days, while for ulcerated forms a statistically significant different value was observed (60 days), confirming disease progression from non-ulcerated to ulcerated skin lesions. In addition to the classical forms of BU presentation, the WHO has recognized three levels of increasing severity of lesions. In our cohort, we registered that 66% of the patients presented WHO categories 1 and 2, while 34% presented severe WHO category 3 lesions. Interestingly, time delay in seeking medical assistance did not contribute to the progression of less severe to more severe lesions, since the median time delay for WHO category 1 and 2 lesions (60 days) and category 3 severe lesions (60 days) was the same. The same behaviour was observed restricting analysis to multi-focal lesions and larger lesions, with a diameter superior to 15cm. These observations indicate that, rather than lesions becoming progressively more severe over time, severe lesions present a stable form and therefore should represent a separate phenotype of disease. These results also suggest that host genetic variability can have a strong contribution to the different disease presentations. Taking into consideration the knowledge obtained with this retrospective analysis, we took advantage of the population-based biological bank, composed of DNA samples from 208 BU patients and 300 unrelated healthy individuals. In the first immunogenetic study, we focused on Tumour Necrosis Factor-alpha (TNF-α), a relevant immune-mediator involved in the innate branch of the immune response, known to play a key role in controlling M. ulcerans infection in animal models. Based upon the functional role of the TNFA [-308 Glow → Ahigh (rs1800629)] single nucleotide polymorphism (SNP) on protein production levels, we evaluated the genetic frequency of each allelic variant in cases and controls. We observed that -308 A allele was associated with increased risk susceptibility to BU, considering a recessive model of transmission. This data further reinforces the relevance of TNF-α in BU development, and is in line with data from a previous meta-analysis showing an increased susceptibility to Mycobacterium tuberculosis in individuals carrying this SNP with impact on promoter activity of TNFA. In our second immunogenetic-based study, we evaluated genetic variants in Nucleotidebinding Oligomerization Domain-containing protein 2 ( NOD2), Parkinson disease protein 2 ( PARK2) and Autophagy-related protein 16-1 ( ATG16L1) genes and their impact in susceptibility to BU, given the relevance of autophagy in the host response to mycobacteria. Our data show that the rs1333955 SNP in PARK2 is significantly associated with increased susceptibility to BU. In addition, both the rs9302752 and rs2066842 SNPs in NOD2 genes significantly increased the predisposition of patients to develop category 3 lesions, respectively, whereas the rs2241880 SNP in ATG16L1 was found to significantly protect patients from presenting the ulcer phenotype. In this case, our findings indicate that specific genetic variants in autophagyrelated genes influence susceptibility to BU and its progression to severe phenotypes. Although further studies are needed, our data suggest that disturbances on microtubules and dynein constitution (integrative part of the cytoskeleton of the autophagosome), a process that is known to be affected by mycolactone, might potentially impair the autophagy process and impact the risk and progression of M. ulcerans infection. Overall, our results reinforce the relevance of host genetic variability in the susceptibility/resistance to BU, as well as in the evolution of lesions to distinct phenotypes. Next steps are crucial in functionally validating the relevance of the associated variants on the mechanisms of host susceptibility or resistance to BU, through functional studies with particular emphasis on the immunological function.A úlcera do Buruli (UB) é uma doença infeciosa das regiões tropicais de África, América, Ásia e Austrália. A maioria dos casos ocorre na África Ocidental e esta doença é classificada pela Organização Mundial de Saúde (OMS) como uma doença tropical negligenciada. Esta infeção cutânea necrotizante é causada por Mycobacterium ulcerans, que tem como principal fator de virulência a exotoxina micolactona. Evidências recentes apontam para um papel da variabilidade genética do hospedeiro como contributo relevante para a suscetibilidade na aquisição da UB, bem como para a sua progressão. De fato, nem todos os indivíduos igualmente expostos a M. ulcerans nas zonas húmidas endémicas desenvolvem infeção e os doentes que desenvolvem a doença podem apresentar um largo espectro de manifestações clínicas, incluindo lesões não ulcerativas e ulcerativas. Adicionalmente, pode ocorrer resolução espontânea da infeção e está descrito uma concentração de casos de UB em determinadas famílias. Neste sentido, fica evidente que, para avaliar a influência da variabilidade genética do hospedeiro na suscetibilidade e/ou agressividade da UB, são necessárias novas abordagens. Assim, construímos um banco de amostras biológicas de doentes do Benim, África Ocidental, com caracterização clínico-epidemiológica completa, em associação a uma coorte de controlos endémicos não relacionados, ajustada para idade e género e mantendo contacto e atividades semelhantes com os meios aquáticos. Com esta ferramenta, pode-se avaliar o impacto de diversos polimorfismos genéticos, na sua maioria relacionados com a imunidade inata, não só na suscetibilidade ou resistência à UB, mas também nos distintos fenótipos das manifestações clínicas. Sendo fundamental uma definição clara de fenótipos associados à UB, primeiro planeámos um estudo clínico retrospetivo com pacientes do Benim com diagnóstico de infeção confirmado laboratorialmente. Começámos por avaliar a relação entre a forma clínica de UB e o tempo decorrido entre os primeiros sinais recordados pelos pacientes e a observação clínica (e terapêutica) inicial. Dos 476 pacientes selecionados, 32% apresentavam formas não ulceradas (nódulo, edema ou placa), 67% apresentavam úlcera e apenas 1% apresentava osteomielite. O grupo de doentes com formas não ulceradas teve uma mediana de 32.5 dias de atraso entre os primeiros sintomas e a procura de cuidados médicos, enquanto que o grupo que apresentava úlceras registou um período de atraso significativamente distinto, com uma mediana de 60 dias. Estes dados confirmam que a doença, tipicamente, progride de formas não ulcerativas para úlceras cutâneas. Para além das lesões clássicas de UB, a OMS reconheceu 3 níveis de severidade crescente das lesões de UB. No presente estudo, foram registadas lesões de categoria 1 e 2 em 66% dos doentes, enquanto que 34% dos doentes apresentavam lesões severas de categoria 3. Numa análise subsequente, mostrou-se que o atraso no tempo de procura de cuidados médicos não foi fator contributivo para apresentação de formas mais severas da doença, uma vez que a mediana do atraso para as lesões menos severas de categoria 1 e 2 (60 dias) e para as lesões severas de categoria 3 (60 dias) era a mesma. O mesmo comportamento foi observado quando a análise foi restrita a lesões múltiplas ou lesões de maior diâmetro, acima de 15cm. Mostrámos, assim, que o tempo de progressão natural da doença não determina formas clínicas mais agressivas de UB, sustentando a hipótese de que a variabilidade genética do hospedeiro pode contribuir para manifestações clinicas distintas (fenótipos) da doença. Tendo em conta o conhecimento adquirido com a análise retrospetiva, recorremos ao banco biológico constituído por amostras de DNA de 208 pacientes de UB e 300 controlos saudáveis. No primeiro estudo imunogenético desta tese, investigámos o papel do Fator de Necrose Tumoral-alfa (TNF-α), dado tratar-se de um imunomediador relevante, previamente implicado na resposta inata e com um papel protetor na infeção por M. ulcerans em modelos animais. Com base na alteração funcional resultante do polimorfismo TNFA [-308 Glow → Ahigh (rs1800629)], com impacto nos níveis de TNF-α, avaliámos a frequência alélica da variante nos casos e nos controlos. Observámos que o alelo A estava associado a aumento do risco de suscetibilidade para UB, de acordo com um modelo recessivo de transmissão alélica. Este achado reforça o papel do TNF-α no desenvolvimento da UB e está de acordo com o verificado recentemente numa meta-análise que associa o mesmo alelo ao aumento de suscetibilidade de infeção pelo Mycobacterium tuberculosis. Num segundo estudo imunogenético, avaliámos variantes genéticas nos genes Nucleotide-binding Oligomerization Domain-containing protein 2 ( NOD2), Parkinson disease protein 2 ( PARK2) e Autophagy-related protein 16-1 ( ATG16L1), uma vez que as proteínas que codificam fazem parte, de uma forma complementar, do processo de autofagia. De facto, a maquinaria da autofagia tem vindo a ser implicada, de forma crescente, no controlo e eliminação intracelular de micobactérias, levando-se a hipótese de que variantes genéticas/funcionais tenham impacto na suscetibilidade à UB. Utilizando as mesmas coortes, demonstrámos que o polimorfismo rs1333955 no PARK2 está significativamente associado a um aumento da suscetibilidade a UB. Associámos ainda os polimorfismos rs9302752 e rs2066482 do gene NOD2 ao aumento de predisposição para desenvolvimento de fenótipos mais agressivos de UB (categoria 3 da OMS), respetivamente. Mostrámos também que o polimorfismo rs2241880 do gene ATG16L1 protege os pacientes de desenvolverem o fenótipo de úlcera. Desta forma, demonstrámos que variantes específicas em genes relacionados com o processo de autofagia influenciam, quer a suscetibilidade para o desenvolvimento de UB, quer a progressão para fenótipos distintos da doença. Apesar de serem necessários mais estudos funcionais, os nossos resultados sugerem que interferências na constituição dos microtúbulos e da dineína (parte integrante do citoesqueleto dos auto-fagossomas), processo que é sabido ser afetado pela micolactona, podem ter impacto no risco de infeção e na progressão do processo infecioso por M. ulcerans. Globalmente, os nossos resultados reforçam a importância do papel da variabilidade genética do hospedeiro na suscetibilidade/resistência à UB, assim como na determinação da sua evolução para os diferentes fenótipos característicos desta doença negligenciada. Os próximos passos para validar a relevância destes achados, no que respeita aos mecanismos da suscetibilidade/resistência do hospedeiro à UB, passarão por estudos funcionais, com ênfase na função imunológica.The work presented in this thesis was performed in the Microbiology and Infection Research Domain of the Life and Health Sciences Research Institute (ICVS), School of Health Sciences, University of Minho, Braga, Portugal (ICVS/3B`s – PT Government Associate Laboratory, Braga/Guimarães, Portugal) and in Centre de Dépistage et de Traitement de l’Ulcère de Buruli (CDTUB) in Allada, Benin. The financial support was given by the European Community's Seventh Framework Program (FP7/2007-2013) under grant agreement N° 241500 (BuruliVac); by Infect-ERA (BU_SPONT_HEAL); by Fundação Calouste Gulbenkian under the grant Proc.N° 94776 LJ; from the Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), cofunded by Programa Operacional Regional do Norte (ON.2—O Novo Norte); from the Quadro de Referência Estratégico Nacional (QREN) through the Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) and from the Projeto Estratégico – LA 26 – 2013–2014 (PEst- C/SAU/LA0026/2013)