Search for enzimes of interest in a library of metagenomics of hot spring : Beta-galactosidases

[Resumen] La obtención de β-galactosidasas a partir de metagenotecas de aguas termales, es de especial interés debido a que conservan su actividad a altas temperaturas y son más resistentes que sus homólogas mesófilas, permitiendo llevar a cabo la hidrólisis de la lactosa en diversos procesos de la industria alimentaria. T. thermophilus MD158 es una cepa mutante que no posee los genes que codifican β-galactosidasas y carece de pigmentación, por tanto, se trata de un sistema ideal para identificar las colonias transformadas que incorporaron los genes que codifican para β-galactosidasas; capaces de hidrolizar el sustrato X-Gal proporcionando coloración azul. T. thermophilus requiere una composición mineral característica para su crecimiento y eficiencia enzimática. La actividad de sus enzimas disminuye incluso con aguas minerales suplementadas con iones. En el presente estudio se ha extraído el ADN de una librería metagenómica de aguas termales del Río Caldo para la transformación y búsqueda funcional de actividad β-galactosidasa en T. thermophilus MD158. Asimismo, se han estudiado las diferencias de crecimiento de T. thermophilus HB27 en diversas aguas. Los resultados obtenidos en el crecimiento de T. thermophilus indican que el pH es el factor más influyente, así como la composición mineral no es significativamente importante. En la extracción de ADN de la librería metagenómica se obtuvieron eficiencias muy elevadas con unas concentraciones que abarcan desde los 10 a los 6000 ng/μL. Asimismo, los resultados obtenidos de la transformación y búsqueda de actividad β-galactosidasa ponen de manifiesto la necesidad de utilizar otro huésped y el requerimiento de un método de doble selección para optimizar el método y poder aislar adecuadamente los candidatos positivos.[Abstract] Obtaining β-galactosidases from hotspring metagenomic libraries, is of special interest because they retain their activity at high temperatures and they are more resistant than their mesophilic counterparts, allowing to perform the hydrolysis of lactose in different food industry processes. T. thermophilus MD158 is a mutant strain which lacks the genes encoding β-galactosidase and pigmentation, therefore it is ideal to identify the transformed colonies that have incorporated genes that codify β-galactosidase; wich are able to hydrolyze the substrate X-Gal providing blue colour. T. thermophilus requires a characteristic mineral composition for growth and enzyme efficiency. The activity of its enzymes decreases even in mineral water supplemented with ions. In the present study, the DNA from a metagenomic library of Rio Caldo hotspring has been extracted for the further transformation and functional β-galactosidase search activity in T. thermophilus MD158. The differences in growth of T. thermophilus HB27 in different waters have also been studied. The results in the growth of T. thermophilus indicate that pH is the most influential factor as well as the mineral composition is not significantly important. In the DNA extraction of the metagenomic library very high efficiencies were obtained, with concentrations ranging from 10-6000 ng/μL. Also, the results of the transformation and and the β-galactosidase activity search demonstrate the need for another guest and that it would require a double selection method to optimize the method and to properly isolate the positive candidates.Traballo fin de grao (UDC.CIE). Bioloxía. Curso 2015/201