Avaliação farmacológica de extratos vegetais da Chapada Diamantina (Baía, Brasil): Importância das propriedades antioxidantes e citotóxicas

Tese de Doutoramento em Biologia de Plantas MAP - BioplantA Organização Mundial de Saúde estima que cerca de 80% da população dos países em desenvolvimento (65% da população mundial) utiliza a medicina tradicional nos seus cuidados de saúde. As plantas têm sido importantes fontes de compostos bioactivos e o Brasil está entre as nações com maior biodiversidade do mundo, fazendo deste país um importante local para pesquisa nesta área. Esta tese focou-se na avaliação farmacológica de quatro extractos de plantas provenientes da Chapada Diamantina (Baía, Brasil), em particular nas propriedades antioxidantes e citotóxicas. Para tal, começou-se por documentar as plantas medicinais utilizadas pela comunidade de Igatu, localizada na Baía, Brasil, tendo-se selecionado quatro plantas com potencial de bioprospeção, nomeadamente a Poiretia bahiana C. Mueller, o Acritopappus confertus (Gardner) R. M. King & H. Rob., a Cuphea carthagenensis (Jacq.) J. F. Macbr., e a Polygala multiceps Mart. ex A.W. Benn. Estas plantas foram selecionadas devido ao elevado uso por parte da comunidade de Igatu, devido à escassez de dados quanto à sua composição química e porque, para além do seu uso tradicional, existem poucos estudos científicos no que diz respeito às propriedades farmacológicas. A Poiretia bahiana, conhecida como “arruda-daserra” é usada localmente nas infeções e problemas respiratórios; o Acritopappus confertus ou “cura-facada” é usado tradicionalmente para travar hemorragias; a Cuphea carthagenensis, também conhecida como “sete-sangrias” é usada pela comunidade de Igatu para o tratamento de desordens hepáticas; e finalmente a Polygala multiceps ou “Poliga” é utilizada em casos de dor muscular, febre, tosse e fadiga. A caracterização fitoquímica dos quatro extractos etanólicos recorrendo a cromatografia líquida de alto desempenho com um detetor diode-array (HPLC-DAD), combinado com espectrofotometria de massa (HPLC-DAD-MS), evidenciou a presença de diversos compostos fenólicos, incluindo flavonóides e ácidos fenólicos. Alguns deles, observados pela primeira vez nas plantas, podem estar relacionados com o efeito protetor observado pelos extractos vegetais (nos tratamentos de pré- e co-incubação), especialmente na Cuphea carthagenensis e na Polygala multiceps a nível da citotoxicidade induzida pelo t-BOOH nas células HepG2. A toxicidade pelo t-BOOH está associada à peroxidação lipídica e ruptura dos sistemas antioxidantes intracelulares, e a atividade hepatoprotetora observada dos extratos vegetais pode estar relacionada com a inibição da peroxidação lipídica, aumento dos níveis de enzimas antioxidantes e com o “scavenging” de radicais livres. O extrato vegetal de Polygala multiceps exibiu um efeito efetivo de “scavenging” a nível do radical superóxido e da capacidade quelatora do ferro (Fe2+). A incubação das células HepG2 com os extratos de Cuphea carthagenensis e Polygala multiceps também induziu um aumento significativo nos níveis de GSH e na expressão de várias enzimas citoprotetoras (ex.: HO-1, GCLC, GCLM e NQO1). A Poiretia bahiana e o Acritopappus confertus comportaram-se como extractos mais tóxicos nos ensaios de hepatoproteção e capacidade antioxidante, como tal as propriedades citotóxicas e o potencial pro-apoptótico destes extractos, contra diferentes linhas celulares cancerígenas humanas (HepG2, HCT116, T47D, SH-SY5Y, U87 e LNCaP), foram avaliados. Numerosos compostos encontrados nas plantas parecem ter propriedades anticancerígenas, como acontece com os alcalóides, os fenilpropanóides, os compostos polifenólicos e os terpenóides. Os extratos de Poiretia bahiana e Acritopappus confertus podem conter um ou mais desses compostos com atividade preventiva do cancro e/ou propriedades terapêuticas, como ação direta anticancerígena. De facto, alguns compostos fenólicos presentes no extrato etanólico de Acritopappus confertus como o ácido chicórico, o ácido cinâmico e o ácido 12-Ometilcarnósico; e presentes no extracto de Poiretia bahiana como o ácido cafeoilquínico e o ácido cafeoilferuloiltartárico podem ser responsáveis pelos efeitos citotóxicos e apoptóticos observados nas linhas celulares cancerígenas testadas. No entanto, e de uma maneira geral, o extrato de Poiretia bahiana foi mais ativo, o que pode estar relacionado com as diferenças expectáveis na sua composição. Este extrato também demonstrou mais seletividade para as células cancerígenas de próstata (LNCaP) comparativamente às células normais de próstata (RWPE-1), com um índice de seletividade superior a 10, demonstrando o seu potencial para uso biofarmacêutico. A citotoxicidade significativa dos extratos etanólicos de Acritopappus confertus e Poiretia bahiana a nível das células HCT116 parece ser resultado da indução de morte celular por apoptose. De um modo geral, os resultados observados na tese providenciam uma importante base para estudos futuros, no sentido de elucidar a relação entre a estrutura química dos compostos presentes nos extratos e os seus efeitos protetores e citotóxicos.The World Health Organization estimates that 80% of people in developing countries (65% of the world’s population) still rely on traditional medicine. Plants have been rich sources of medicines and Brazil is among the most biodiverse nations in the world, making this country a great source of research in the area. Thus, the search for new plant derived chemicals should be a priority in current and future efforts toward sustainable conservation and rational use of biodiversity. In this thesis we focus on the pharmacological evaluation of four plant extracts from Chapada Diamantina (Bahia, Brazil), particularly the antioxidant and cytotoxic properties. For that, we started the work by documenting the medicinal plant use in the community of Igatu, located in Bahia, Brazil, and select four plants with bioprospecting potential, namely Poiretia bahiana C. Mueller, Acritopappus confertus (Gardner) R. M. King & H. Rob., Cuphea carthagenensis (Jacq.) J. F. Macbr., and Polygala multiceps Mart. ex A.W. Benn. These plants were selected based on their high use among the community, because their chemistry is poorly known and because despite its traditional use, there is a lack of investigations on their pharmacological properties. Poiretia bahiana, known as “arruda-da-serra” is used locally for infections and respiratory infections; Acritopappus confertus or “cura-facada” is used traditionally to stop bleedings; Cuphea carthagenensis, also known as “sete-sangrias” is used by the community of Igatu for the treatment of hepatic disorders; and finally Polygala multiceps or “Poliga” is used in the case of muscular pain, flu, cough and fatigue. Phytochemical characterization of the four alcoholic extracts by HPLC and Diode Array (DAD) combined with Mass Spectrometry (HPLC-DAD-MS) evidenced the presence of several phenolics, including flavonoids and phenolic acids. Some of these compounds, observed for the first time in the plants, may be related to the observed protective effects of the plant extracts (in pre- and co-incubation treatments), especially Cuphea carthagenensis and Polygala multiceps, on cytotoxicity induced by t-BOOH in HepG2 cells. The toxicity induced by t-BOOH is associated with lipid peroxidation and disruption of intracellular antioxidant systems and this hepatoprotective activity of plant extracts may be due to the inhibition of lipid peroxidation, enhancement of the antioxidant enzyme levels and by free radical scavenging. P. multiceps exhibited effective scavenging of superoxide radical and Fe2+ chelating ability. Incubation of HepG2 cells with Cuphea carthagenensis and Polygala multiceps extracts also induced significantly increased in GSH levels and expression of several cytoprotective enzymes (e.g. HO-1, the subunits of the ratelimiting enzyme of GSH synthesis GCLC and GCLM, as well as the antioxidant and drugmetabolizing enzyme NQO1). Poiretia bahiana and Acritopappus confertus showed more toxicity, so the cytotoxic properties and pro-apoptotic potential of these extracts against different human cancer cell lines were evaluated (HepG2, HCT116, T47D, SH-SY5Y, U87 and LNCaP). Numerous compounds found in plants are also known to possess anticancer properties, such as alkaloids, phenylpropanoids, polyphenolics and terpenoids. The extracts of Poiretia bahiana and Acritopappus confertus may contain one or more of these compounds that possess cancer preventive and/or therapeutic properties, like direct anticancer action. In fact, some phenolic compounds present in the ethanolic extract of Acritopappus confertus like chicoric acid, cinnamic acid and 12-O-methylcarnosic acid; and of Poiretia bahiana like caffeoylquinic acid and caffeoylferuloyltartaric acid, may be responsible for the cytotoxic and apoptotic effects on the tested cancer cell lines. The plant extracts of Poiretia bahiana and Acritopappus confertus demonstrated, in general, cytotoxic activity against all cell lines tested. However, overall the extract of Poiretia bahiana was more active, which may be due to the differences in their composition. The plant extract also demonstrated more selectivity to the LNCaP cells as compared to RWPE-1 cells (normal counterpart cells), with selectivity index higher than 10, indicating its potential for biopharmaceutical use. The significant cytotoxicity activity of ethanolic extracts of Acritopappus confertus and Poiretia bahiana in HCT116 cells are thought to be a result of the induction of cell death by apoptosis. Overall, the results presented in this thesis provide an important basis for further studies in order to elucidate the relationship between the chemical structures of the compounds present in plant extracts and their protective and cytotoxic effects.Este trabalho foi apoiado financeiramente pela Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), projetos PTDC/AGR-ALI/105169/2008 e PEst-OE/AGR/UI4033/2014, e pela Escola Superior de Tecnologia da Saúde do Porto (ESTSP) e Instituto Politécnico do Porto (IPP) (art.º 7.º do Regulamento do Programa, aprovado através do Despacho IPP/P-058/2010, de 21 de abril)