Abordagens de biologia de sistemas para a obtenção de novas estirpes vínicas de Saccharomyces cerevisiae com produção melhorada de compostos de aroma e sabor

Tese de Doutoramento em Biologia Ambiental e MolecularWine flavour and aroma are the result of yeast metabolism and must compounds interactions. During must fermentation thousands of volatile aroma compounds are formed, with higher alcohols, acetate esters and ethyl esters being the main aromatic compounds contributing to a floral and fruity aroma. The action of yeast, in particular of Saccharomyces cerevisiae strains, on the must components will build the architecture of the wine flavour and their fermentation bouquet. Only a holistic approach based on systems biology, an inter-disciplinary area combining the study of biology, chemistry, physics and mathematics, based on data-driven and model-based elucidation of complex biological systems, will allow the complete understanding on the vast and dynamical relationships between genomics, phenomics and metabolomics. In this work a S. cerevisiae collection was constituded comprising 172 strains of worldwide geographical origins and different technological applications. This collection was characterized regarding 30 physiological traits that are important mostly from an oenological point of view. From the different traits studied, growth in the presence of potassium bisulphite, growth at 40 ºC, and resistance to ethanol contributed the most to strain variability, as shown by the principal component analysis. Computational methods were developed in order to assess the importance of phenotypic features to identify candidate strains to be used commercially in winemaking. In particular, the probability of a strain to be assigned to the group of commercial strains was 27% using the entire phenotypic profile and increased to 95%, when only results from the three tests suggested by the model were considered. Results show the usefulness of the mentioned approaches to simplify strain selection procedures. In addition to the phenotypic characterization, we undertook genetic typing of the 172 S. cerevisiae strains, using 11 polymorphic microsatellites. We found 280 alleles, whereas microsatellite ScAAT1 contributed the most to intra-strain variability, together with the alleles 20, 9 and 16, from microsatellites ScAAT4, ScAAT5 and ScAAT6, respectively. These microsatellite allelic profiles are characteristic for both the phenotype and origin of yeast strains. Data were computationally related with the previously obtained results of the 30 phenotypic tests, and the phenotypes associated with higher number of alleles were the capacity to resist to sulphur dioxide (tested by the capacity to grow in the presence of potassium bisulphite) and the presence of galactosidase activity. Our study demonstrated the utility of computational modelling to estimate a strain technological group and phenotype from microsatellite allelic combinations as tools for preliminary yeast strain selection. To better understand the molecular and metabolic bases of aroma production during a fermentation process, we used comparative transcriptomic and metabolic analysis of four yeast strains from different origins and/or technological applications (cachaça, sake, wine, and laboratory), to rationally identify new targets for improving aroma production. Results showed that strains from cachaça, sake and wine presented a higher production of acetate esters, ethyl esters, acids and higher alcohols, in comparison with the laboratory strain S288c. At fermentation time T1 (5 g/L of CO2 released), comparative transcriptomics of these three S. cerevisiae strains from different fermentative environments in comparison with the laboratory yeast S288c, showed an increased expression of genes related with tetracyclic and pentacyclic triterpenes metabolism, involved in sterol synthesis. Sake strain showed also an upregulation of genes ADH7 and AAD6, involved in the formation of higher alcohols in the Ehrlich pathway. For fermentation time point T2 (50 g/L CO2 released), again sake strain, but also wine strain, showed an increased expression of genes involved in formation of higher alcohols in the Ehrlich pathway, namely ADH7, ADH6 and AAD6, which is in accordance with the higher levels of methionol, isobutanol, isoamyl alcohol and phenylethanol observed. Our approach revealed successful to integrate data from several technologies (HPLC, GC-MS and microarrays) and using different data analysis methods (PCA, MFA). The results obtained, increased our knowledge on the association of genes with the formation of metabolic compounds that contribute to the wine aroma and flavour, and showed differences in the metabolism of cachaça, sake and wine strains not yet addressed, and mainly explained by the production of fatty acids, and ethyl and acetate esters.This work was supported by FCT I.P. through the strategic funding UID/BIA/04050/2013 and the project PTDC/AGR-ALI/121062/2010, and Inês Mendes was recipient of a fellowship from the Portuguese Science Foundation, FCT (SFRH/BD/74798/2010).O aroma e o sabor do vinho resultam das interações entre o metabolismo das leveduras e os compostos presentes no mosto. Durante a fermentação do mosto formamse milhares de compostos voláteis, sendo que os álcoois superiores, os esteres de acetato e os esteres de etilo são os compostos que mais contribuem para o aroma floral e frutado. A ação das leveduras, em particular das estirpes de Saccharomyces cerevisiae, nos componentes do mosto contribui para a arquitetura do cheiro do vinho e do seu bouquet fermentativo. Apenas uma visão holística baseada na biologia de sistemas, uma área interdisciplinar que combina o estudo da biologia, química, física e matemática, baseada na elucidação de dados e modelos de sistemas biológicos complexos, permitirá uma completa compreensão das vastas e dinâmicas relações entre genómica, fenómica e metabolómica. No presente trabalho uma coleção de 172 estirpes de S. cerevisiae foi constituída com isolados provenientes de diferentes origens geográficas e diferentes aplicações tecnológicas. O seu fenótipo foi avaliado considerando 30 testes fenotípicos, selecionados de forma a avaliar características importantes do ponto de vista enológico. O crescimento na presença de bissulfito de potássio, crescimento a 40 ˚C e resistência ao etanol foram os fenótipos que mais contribuíram para a variabilidade entre estirpes, de acordo com o revelado pela análise de componentes principais. Foram desenvolvidos métodos computacionais com o objetivo de avaliar a importância das características fenotípicas na identificação de estirpes candidatas para serem usadas comercialmente na produção de vinho. Em particular, a probabilidade de uma estirpe pertencer ao grupo das estirpes comerciais foi de 27% usando o perfil fenotípico completo e aumentou para 95% quando foram apenas considerados os 3 testes sugeridos pelo modelo. Os resultados mostraram a utilidade dos métodos mencionados para simplificar os procedimentos de seleção de estirpes. Além da caracterização fenotípica, fez-se a tipagem genética das 172 estirpes de S. cerevisiae, usando para isso 11 microssatélites polimórficos. A caracterização genética identificou 280 alelos, sendo o microssatélite ScAAT1 o que mais contribuiu para a variabilidade entre estirpes, em conjunto com os alelos 20, 9 e 16 dos microssatélites ScAAT4, ScAAT5 e ScAAT6, respetivamente. Este perfil alélico de microssatélites revelou-se como característico tanto para o fenótipo como para a origem da estirpe de levedura. Estes dados foram relacionados computacionalmente com os resultados obtidos previamente para os 30 testes fenotípicos e os fenótipos associados com o maior número de alelos foram a capacidade de resistir ao dióxido de enxofre (testado pela capacidade de crescer na presença de bissulfito de potássio) e a presença de atividade da galactosidase. Este estudo demonstrou a utilidade da modelação computacional para fazer uma estimativa do grupo tecnológico de uma estirpe e do seu fenótipo a partir de combinações alélicas de microssatélites como ferramentas para seleção preliminar de estirpes de leveduras. De forma a contribuir para uma melhor compreensão das bases moleculares e metabólicas da produção de aroma durante o processo fermentativo, fez-se transcritómica comparativa e análise metabólica de quatro estirpes de levedura com diferentes origens e /ou aplicações tecnológicas (cachaça, saké, vinho e laboratório), para identificar novos alvos para o melhoramento da produção de aroma. Os resultados mostraram que as estirpes de cachaça, saké e vinho apresentaram uma maior produção de esteres de acetato, esteres de etilo e álcoois superiores, em comparação com a estirpe laboratorial S288c. No tempo de fermentação T1 (5 g/L de CO2 libertado), a transcritómica comparativa das três estirpes de S. cerevisiae obtidas em diferentes ambientes fermentativos em comparação com a estirpe laboratorial S288c, mostrou um aumento da expressão de genes relacionados com o metabolismo dos triterpenos tetracíclicos e pentacíclicos, envolvidos na síntese de esteróis. A estirpe de saké mostrou também um aumento na regulação dos genes ADH7 e AAD6, envolvidos na formação de álcoois superiores na via de Ehrlich. Para o tempo de fermentação T2 (50 g/L de CO2 libertado), mais uma vez a estirpe de saké, mas também a estirpe vínica, mostraram um aumento da expressão de genes envolvidos na formação de álcoois superiores na via de Ehrlich, nomeadamente ADH7, ADH6 e AAD6, o que está de acordo com elevados níveis de metionol, isobutanol, álcool isoamilico e feniletanol observados. A nossa abordagem revelou-se bem-sucedida para integrar dados de diferentes plataformas (HPLC, GC-MS e microarrays) e usando diferentes métodos de análise de dados (PCA, MFA). Os resultados obtidos aumentaram o conhecimento sobre a associação de genes com vias de formação de compostos que contribuem para o aroma e sabor do vinho, e mostraram diferenças no metabolismo das estirpes de cachaça, saké e vinho que não tinham ainda sido investigadas, e principalmente explicadas pela produção de ácidos gordos, e esteres de etilo e de acetato