Role of mannitol in the defense of Olea europaea and Vitis vinifera against drought and salinity

Tese de doutoramento em Ciências (especialidade de Biologia)Plants are generally well adapted to a wide range of environmental conditions. Even though they have notably prospered in our planet, stressful conditions such as salinity, drought, cold or heat, which are increasingly affecting large areas worldwide in the context of the ongoing climate changes, significantly limit their growth and productivity. For instance, global climate change is currently a big concern for viticulturists and enologists, as grape berry composition depends immensely on the environment. Behind the remarkable ability of plants to cope with these stresses and still thrive, sophisticated and efficient mechanisms to re-establish and maintain ion and cellular homeostasis are involved. Among the plant arsenal to keep homeostasis are efficient stress sensing and signaling mechanisms, plant cell detoxification systems, compatible solute and osmoprotectant accumulation and a vital rearrangement of solute transport and compartmentation. The key role of mannitol, of its transport systems and metabolism in cellular homeostasis in Olea europaea and Vitis vinifera was addressed in the present work. Polyols are the reduced form of aldoses and ketoses, present in several plant species, and mannitol is one of the most disseminated. In O. europaea a mannitol transport system (OeMaT1) had been previously characterized as a key component in olive tolerance to salinity. In the present work, biochemical and molecular studies were performed in heterotrophic sink models, such as olive cell suspensions and fruit tissues to elucidate some key biochemical and molecular steps involved in the transport and metabolism of mannitol, and how this polyol may improve salt and drought stress resistance of O.europaea. The kinetic parameters of mannitol dehydrogenase (OeMTD) the enzyme catalyzing the first step of mannitol oxidation, determined in mannitol-growing cells, were as follows: Km, 54.5 mM mannitol and Vmax, 0.47 μmol h-1 mg-1 protein. A corresponding cDNA was cloned and designated OeMTD1. OeMTD1 expression levels were correlated with MTD biochemical activity, OeMaT1 expression and carrier-mediated mannitol uptake, in mannitol- and sucrosegrowing cells. MTD activity and OeMTD1 expression were significantly repressed by salt and drought stress. In contrast, mannitol uptake and OeMaT1 expression were enhanced, suggesting that olive tree copes with salinity and drought by coordinating mannitol transport with intracellular metabolism allowing intracellular accumulation of this polyol. The molecular features of polyol transport and metabolism, as well as their regulation and physiological relevance in V. vinifera, particularly in the grape berry, were practically unknown so far. In the present work, the biochemical function of a grapevine polyol transporter cloned from the fruit mesocarp (VvPLT1) was characterized after heterologous expression in yeast. This plasma membrane symporter transports mannitol with a Km of 5.4 mM, among a broad range of polyols and monosaccharides. Furthermore, VvPLT1 expression increased in grape berry pulp cells at mature and full mature stages, thus contributing to increased loading rates to sink cells and significant accumulation of polyols under severe drought. Moreover, a shift in the metabolism of mannitol and sorbitol via polyol dehydrogenases towards the simultaneous inhibition of polyol oxidation and increased fructose reduction into mannitol may also result in a higher intracellular pool of these osmoprotective compounds. Integrating metabolomics with directed transcriptomics and classical biochemical approaches, we demonstrated that polyols have an important impact not only in the grape berry composition, but also in the response of grapevine to water stress, in a synchronized expedite strategy from transport to metabolic steps. The full understanding of the plant cell complex defense mechanisms under stress may allow for the engineering of more tolerant plants or the optimization of agricultural practices to improve quality and productivity, which is crucial as food resources are progressively scarce and in the context of the ongoing climate changes.As plantas são organismos bem adaptados a uma grande variedade de condições ambientais. Contudo, embora tenham prosperado de forma notável no nosso planeta, condições ambientais como a elevada salinidade, secura, frio ou calor limitam significativamente o seu crescimento e produtividade. Estas condições de stresse têm-se tornado ainda mais adversas em grandes áreas do globo no contexto das alterações climatéricas em curso. Com efeito, os fenómenos climatéricos extremos constituem uma grande preocupação para os viticultores e enólogos uma vez que afectam particularmente a composição do bago de uva. A capacidade das plantas em lidar com estas agressões ambientais e ainda assim prosperarem assenta em sofisticados mas eficientes mecanismos de homeostasia iónica e celular. Do arsenal que as plantas dispõem para repor a homeostasia fazem parte: i) eficientes mecanismos de detecção e de sinalização de factores de stresse, ii) sistemas de destoxificação celular e de acumulação de solutos compatíveis e osmoprotetores e iii) transportadores membranares de solutos com vista à sua compartimentação celular ou extrusão da célula. No presente trabalho foi estudado o papel chave do manitol, bem como dos sistemas de transporte transmembranar e do metabolismo deste soluto na homeostasia celular em Olea europaea e Vitis vinifera. Os polióis são formas reduzidas de aldoses e de cetoses presentes em várias espécies de plantas, sendo o manitol um dos polióis mais abundantes. Em O. europaea, foi previamente caracterizado um sistema de transporte de manitol (OeMaT1) ao qual foi atribuído um papel importante na tolerância à salinidade. No presente trabalho foram desenvolvidos estudos bioquímicos e moleculares recorrendo a culturas celulares e a tecidos do fruto como modelos para a compreensão dos mecanismos de transporte e metabolismo do manitol, bem como do papel do manitol na resposta da oliveira ao stresse salino e à secura. Em células em suspensão cultivadas em meio mineral com manitol foi estudada a atividade da manitol desidrogenase (OeMTD), enzima que catalisa o primeiro passo de oxidação do manitol, tendo sido obtidos os seguintes parâmetros cinéticos: Km, 54,5 mM de manitol e Vmax, 0,47 μmol h-1 mg-1 de proteína. A sequência de cDNA correspondente a esta manitol desidrogenase foi clonada (OeMTD1), e os níveis de transcritos dos genes OeMTD1 e OeMaT1 foram avaliados e comparados com as atividades da enzima manitol desidrogenase e do sistema de transporte do manitol em células cultivadas na presença de manitol ou sacarose sujeitas a diferentes situações de stress. Os resultados mostraram que a imposição de um stress hídrico ou salino conduziu à repressão da atividade da manitol desidrogenase e à diminuição dos níveis de transcritos do gene OeMTD1. Em paralelo, foi observado um aumento significativo do transporte transmembranar do manitol bem como da expressão do gene OeMaT1. Estes resultados sugeriram que a coordenação da taxa de transporte do manitol com o seu metabolismo intracelular constituem mecanismos de resposta à salinidade e à secura, por conduzirem à acumulação intracelular do poliol. O trabalho prosseguiu com vista ao estudo dos mecanismos moleculares do transporte e metabolismo de polióis, bem como dos correspondentes mecanismos de regulação, em Vitis vinifera para se avaliar a importância fisiológica dos polióis, em particular no bago. Neste âmbito, o gene VvPLT1 (Vitis vinifera Polyol Transporter 1) foi clonado a partir dos tecidos do bago e a sua função como transportador de polióis foi demonstrada após expressão heteróloga em levedura. O sistema de transporte medeia a entrada de manitol com um Km = 5.4 mM e foi capaz de transportar uma ampla variedade de polióis e de monossacarídeos. Quando se estudou a expressão do VvPLT1 durante o desenvolvimento do bago, verificou-se que os níveis de transcritos aumentaram na fase final do amadurecimento, em particular quando as videiras foram sujeitas a condições de secura, contribuindo para um aumento significativo dos níveis de polióis no bago. Adicionalmente, foi observada uma alteração do metabolismo do manitol e do sorbitol nos tecidos do bago, quando se mediu uma inibição das taxas de oxidação destes compostos mediada pelas poliol desidrogenases e um aumento da taxa de redução de frutose a manitol, contribuindo para o aumento dos níveis intracelulares destes compostos osmoprotetores. Ao integrarmos abordagens de metabolómica e de transcriptómica dirigida com abordagens de bioquímica clássica, demonstrámos que os polióis têm um impacto importante na composição do bago de uva em particular quando as videiras são sujeitas a stresse hídrico. Nestas condições, as plantas recorrem a uma estratégia expedita e sincronizada que regula o transporte dos polióis bem como os passos metabólicos intracelulares de oxidação ou redução. A compreensão aprofundada dos mecanismos moleculares e celulares complexos de resposta das plantas ao stresse poderá permitir a criação de plantas mais tolerantes por abordagens de engenharia genética ou à optimização de práticas agrícolas de modo a melhorar a sua qualidade e produtividade. Estas estratégias tornam-se particularmente relevantes à medida que os recursos alimentares do planeta tendem a escassear com o aumento exponencial da população e com o aumento da frequência de fenómenos climatéricos extremos no contexto das alterações climatéricas em curso