Entomopathogenic fungi associated to Prays oleae: isolation, characterization and selection for biological control

Tese de doutoramento em Ciências (área de especialiação em Biologia)Entomopathogenic fungi (EF) are nowadays considered one of the most promising alternatives to chemical pesticides. The use of fungal species or strains recovered from and adapted to a specific environment and host will increase the chances of success of biocontrol measures. In this work, we focused on one of the major pests affecting the olive culture, the lepidopteran Prays oleae Bern. A revision of available knowledge on entomopathogenic fungi is presented, focusing on their ecology and environmental factors that affected their occurrence, abundance and diversity. The infection mechanism is also addressed, as well as the enzymes and toxins related to both insect infection and death. The review on the compatibility of EF with chemical pesticides and other biological methods of pest control shows that different outcomes of those interactions are to be expected. Finally we address the current data about the use of EF for the control of olive pests. The first step was to ascertain which fungal entomopathogenic species were associated to P. oleae in an olive ecosystem. The undertaken survey, on larvae and pupae of the three annual generations (phyllophagous, antophagous and carpophagous) of P. oleae resulted in the identification of 43 species from 24 genera. Besides species best described as phytopathogenic, a large number of possible biocontrol agents, including antagonistic and entomopathogenic fungal species were found. Beauveria bassiana was the one found in higher abundance, especially in the phyllophagous generation. The internal transcribed spacer (ITS) region has been adopted as a barcode region for fungi, although many doubts still persist about the reliability of this marker. This work intends to evaluate and compare the efficiency of different molecular barcode markers (ITS, β-tubulin and RPB2), by amplifying these regions of fungal isolates retrieved from mycosed larvae and pupae of P. oleae. Although results showed higher performance of the ITS region, use of multiple barcode regions for fungal identification should be considered, as the use of β-tubulin and RBP2 increased the number of identified sequences. This multi-locus approach allowed the identification of fungal species associated with the death of larvae and pupae of P. oleae that present distinct roles in the ecosystem. The pathogenicity of four isolates of the major fungal taxa identified, B. bassiana, was evaluated on a lepidopteran pest of chestnut, Cydia splendana. The use of six concentrations of each fungal isolates showed a time- and concentration-dependent mortality of larvae, with mortalities ranging from 40 to 100%. Variations of virulence parameters were detected between isolates, both for median lethal concentration (LC50) and median lethal time (LT50). The results showed a high susceptibility of C. splendana to B. bassiana, indicating that EF can be useful to control this pest. After having determined the presence of EF in olive orchards, and their ability to infect insect pests, we decided to study some factors that can be responsible for the detected variation on their diversity and abundance in olive orchards. One of the studied factors was the impact that soil tillage has on EF. Larvae and pupae were sampled from olive orchards with or without soil tillage, and EF species associated to P. oleae were identified. A total of 120 isolates belonging to 8 EF species were found, being B. bassiana the most abundant one. Although no significant differences were observed between no-till and tilled orchards, higher occurrence, diversity and abundance was found in the former type of soil management. Four species were found exclusively on no-till orchards, indicating that the presence of natural vegetation creates more suitable conditions to EF, in olive orchards. The effect of the olive plant organs (leaves, flowers and fruits) on the manipulation of the entomopathogens B. bassiana and Paecilomyces formosa was studied under in vitro conditions. Both fungi are influenced by olive tree organs, but in different ways: Beauveria bassiana was more negatively affected by olives, while P. formosa was more negatively affected by leaves. Both volatile and diffusible compounds, as well as their interaction, are responsible for the observed effects. These results suggested that olive plant organ may be involved in the recruitment or maintain of specific fungal species which could partly explained the differences on fungal occurrence between P. oleae generations. Overall results showed that a pool of EF, for use as biocontrol agents, can be found in olive orchard, namely found in association to P. oleae, in high diversity and abundance. The most abundant species, B. bassiana, besides being isolated from P. oleae, also showed to be pathogenic to another lepidopteran pest, C. splendana. Of the factors that can interact with EF, different plant organs showed to have considerable influence on fungal behaviour. By other hand, different soil management practices didn‟t result in significant differences, although the presence of natural vegetation appears to be more suitable for EF. Combined information should give a significant thrust forward on research on EF for olive pest control, as more knowledge is needed, for the understanding of the interaction EF- P. oleae- olive tree.Os fungos entomopatogénicos (FE) são, hoje em dia, uma das mais promissoras alternativas aos pesticidas químicos. O uso de espécies ou estirpes fúngicas isoladas e adaptadas a um determinado ecossistema e hospedeiro resultará num aumento das probabilidades de sucesso de métodos de luta biológica. Este trabalho focou-se numa das principais pragas que afecta a cultura da oliveira, o lepidóptero Prays oleae Bern. É apresentada uma revisão sobre o conhecimento disponível sobre os FE, incidindo sobre a sua ecologia, e factores que afectam a sua ocorrência, abundância e diversidade. O mecanismo de infecção destes fungos é também abordado, assim como enzimas e toxinas responsáveis pela infecção e morte do hospedeiro. A compatibilidade de EF com meios de controlo de pragas, quer químicos, quer de luta biológica é também apresentada. Finalmente, apresentam-se os dados disponíveis sobre o uso de FE contra pragas da oliveira. O primeiro passo foi verificar as espécies de FE encontradas associadas a P. oleae no ecossistema olival. A pesquisa efectuada, em larvas e pupas das três gerações anuais (filófaga, antófaga e carpófaga) de P. oleae resultou na identificação de 43 espécies. Para além de espécies descritas como fitopatogénicas, foi encontrado um grande número de possíveis agentes de luta biológica, incluindo espécies de fungos antagonistas e entomopatogénicas. Beauveria bassiana foi a espécie encontrada em maior abundância, principalmente na geração filófaga. A região espaçadora interna transcrita (internal transcribed spacer - ITS) foi recentemente definida como a região padrão -barcode- para os fungos, apesar de ainda subsistirem dúvidas sobre a sua confiabilidade. Este trabalho teve como objectivo avaliar e comparar a eficiência de diferentes regiões barcode (ITS, β-tubulin e RPB2), amplificando-os de isolados fúngicos obtidos de larvas e pupas de P. oleae. Apesar de os resultados mostrarem maior eficiência da região ITS, o uso de múltiplas regiões deve ser considerado, uma vez que aumenta o número de sequências identificadas. Esta abordagem multi-regiões permitiu a identificação de fungos associados a P. oleae, com distintas funções no ecossistema. A patogenicidade de quatro isolados da principal espécie identificada, B. bassiana, foi avaliada em Cydia splendana, um lepidóptero praga da cultura da castanha. A utilização de seis concentrações de cada isolado mostrou uma mortalidade de larvas dependente do tempo e da concentração, com valores compreendidos entre 40 a 100% de mortalidade. Variações nos parâmetros de virulência foram detectados entre isolados, quer na concentração letal média (LC50), quer no tempo letal médio (LT50). Os resultados mostraram uma alta susceptibilidade de C. splendana à infecção por B. bassiana, indicando que os FE podem ser úteis para o controlo desta praga. Após ter sido determinada a presença de FE em olivais, e a sua capacidade de infectar insectos, foram estudados alguns factores que poderão influenciar a sua diversidade e abundância nos olivais. Um desses factores estudados foi o impacto da mobilização do solo nos FE. Foram recolhidas larvas e pupas da praga em olivais com e sem mobilização de solo, identificando-se as espécies isoladas. No total, 120 isolados, pertencentes a 8 espécies de FE foram identificados, sendo B. bassiana a mais abundante. Apesar de não terem sido detectadas diferenças significativas entre olivais com e sem mobilização solo, foi observada maior ocorrência, diversidade e abundância em solos sem mobilização. Quatro espécies de FE foram encontradas exclusivamente em olivais sem mobilização, indicando que a vegetação natural pode criar condições mais favoráveis aos FE. O efeito dos órgãos de oliveira (folhas, flores e frutos) nos FE B. bassiana e Paecilomyces formosa foi estudado em condições in vitro. Ambas as espécies foram influenciadas pelos órgãos da oliveira, ainda que de forma distinta. Beauveria bassiana foi negativamente mais afectada pelos frutos, sendo que P. formosa foi negativamente mais afectada pelas folhas. Compostos voláteis, difusíveis, e a sua interacção são responsáveis pelos efeitos observados. Estes resultados sugerem que os órgãos da oliveira podem estar envolvidos no recrutamento ou manutenção de FE específicos, o que pode explicar, parcialmente, as diferenças na ocorrência de FE entre gerações de P. oleae. Os resultados globais revelaram a existência de um conjunto de FE no olival, em associação com P. oleae e em grande abundância e diversidade, que podem ser explorados como agentes de luta biológica. A espécie mais abundante, B. bassiana, além de isolada de P. oleae, também se mostrou patogénica em outra praga, C. splendana. Entre os factores que podem interagir com FE, os diferentes órgãos da planta mostraram ter uma influência considerável sobre o comportamento dos fungos. Por outro lado, os diferentes sistemas de maneio do solo não causaram diferenças significativas, embora a presença de vegetação natural pareça beneficiar os FE. A informação resultante deste trabalho deverá dar um impulso significativo à pesquisa sobre FE para a luta contra pragas de oliveira, uma vez que mais informação é necessária, para a compreensão da interacção FE- P. oleae- oliveira