Verrouillage cinétique et suivi nanométrique de l'extension d'acides nucléiques au moyen de pinces magnétiques super-résolues

Les pinces magnétiques constituent l’une des techniques utilisées pour manipuler des molécules biologiques uniques. La micromanipulation de ces molécules permet en particulier d’étudier leurs propriétés thermodynamiques ainsi que leur interaction avec les protéines impliquées dans leur réplication et leur traduction. Ces données sont obtenues en mesurant les changements d’extension d’acides nuclétiques accrochées entre une bille magnétique et une surface fonctionnalisée. Le suivi optique de la position en 3D de la bille magnétique permet de mesurer ces changements. Jusqu’à présent, la limite de résolution de ce suivi se situe autour de 2 nanomètres.Ce travail introduit une technique de superrésolution optique, la stéréo-interférométrie en fond noir, qui permet d’augmenter significativement la résolution optique du suivi et d’atteindre des échelles sous-nanométriques. Nous allons présenter des applications de cette nouvelle résolution à l’étude de la cinétique d’hybridisation d’oligonucléotides courts ainsi qu’à l’étude des interactions entre hélicases et acides nucléiques. Nous allons ensuite décrire comment les couplages hydrodynamiques près de la surface induisent une diminution drastique de la résolution spatio-temporelle de notre appareil malgré l'amélioration de la résolution optique. Enfin, nous allons introduire une nouvelle méthode basée sur ces pinces magnétiques superrésolues, que nous appelons verrouillage cinétique : en utilisant une épingle à cheveux d’acides nucléiques fluctuant rapidement, elle permet la détection d’évènements d’accrochage qui ne mettent en jeu aucun changement mesurable d’extensionMagnetic tweezers (MT) are one of the techniques used to micromanipulate biomolecules. In particular, micromanipulating nucleic acids with MT allows one to investigate their thermodynamical properties as well as their interaction with proteins involved in their replication, their transcription or their topological rearrangement. These studies are performed by measuring the extension changes of nucleic acids tethered between a micrometric magnetic bead and a surface. The optical measurement of the 3D position of the magnetic bead allows to detect these changes. So far, the resolution of this tracking is roughly 2 nm.This work will introduce a superresolution technique, Stereo Darkfield Interferometry, that allowed us to increase significantly the optical resolution of the tracking, down to the subnanometer range. We will also describe how the hydrodynamic couplings close to the glass surface result in a dramatic loss of spatio-temporal resolution in spite of the enhancement of the optical precision. We will show some applications of this new resolution to the characterization of helicases and to the study of the hybridization of short oligonucleotides. We will also present a MT-based method, that we called kinetic locking. Based on a DNA fluctuating probe, it enables measurements that do not involve measurable extension changes