Vers une meilleure compréhension de la reconnaissance des substrats naturels et non-naturels des synthases de cyclodipeptides

Cyclodipeptides and their complex derivatives, the diketopiperazines (DKPs), constitute a large class of natural products with diverse and noteworthy pharmacological activities observed for many naturally occurring DKPs. A promising approach to generate diverse DKPs is to study and manipulate DKP biosynthetic pathways. Cyclodipeptide synthases (CDPSs) constitute an enzyme family dedicated to the synthesis of cyclodipeptides, with the particularity to use aminoacylated-tRNAs (AA-tRNAs) as substrates. In order to unlock the biosynthetic potential of these enzymes, better understanding their specificity, in particular towards non-natural substrates, is required.In this thesis, we first significantly expanded the diversity of cyclodipeptides accessible with CDPSs by showing that CDPSs could incorporate non-canonical amino acids, through the use of the promiscuity of E. coli aminoacyl-tRNA synthetases. Then, we gave new insights into the recognition by CDPSs of the tRNA moieties of their substrates. By using an innovative RNA acylation strategy based on a class of ribozymes called flexizymes, we generated analogues of AA-tRNAs with truncated RNA moieties. Among these “AA-minitRNAs”, we showed that those mimicking the entire 7 bp stems of tRNAs are as good substrates as AA-tRNAs, which suggests that CDPSs interact mainly with the acceptor arms of tRNAs and paves the way for promising biophysical and structural studies.Les cyclodipeptides constituent, avec leurs dérivés plus complexes les dicétopiperazines (DKP), une importante famille de produits naturels, synthétisés essentiellement par des micro-organismes. Une approche intéressante pour synthétiser une grande diversité de DKP consiste à étudier et manipuler les voies de biosynthèse de ces molécules. Les synthases de cyclodipeptides (CDPS) constituent une famille d’enzymes dédiés à la production de cyclodipeptides, qui ont la particularité d’utiliser les ARNt aminoacylés (AA-ARNt) comme substrats. Afin d’exploiter complètement le potentiel de ces enzymes, il est nécessaire de mieux comprendre leur spécificité, notamment vis-à-vis de substrats non naturels. Dans cette thèse, nous avons tout d’abord démontré que les CDPS sont capables d’incorporer des acides aminés non naturels, en utilisant la promiscuité des aminoacyl-ARNt synthétases (AARS) d’Escherichia coli. Puis nous avons amélioré notre compréhension de la reconnaissance de la partie ARNt des susbtrats par les CDPS. En utilisant les flexizymes, des ribozymes à activité AARS, nous avons généré des analogues d’AA-ARNt avec des parties ARNt tronquées. Nous avons pu montrer que des « mini AA-ARNt » reproduisant les 7 paires de bases du bras accepteur des ARNt sont d’aussi bons substrats que les AA-ARNt complets, ce qui suggère que les CDPS interagissent principalement avec les bras accepteurs de leurs substrats ARNt