Dynamique de la chromatine et transcription

La dynamique de la chromatine est affectée par les processus biologiques. Pour comprendre comment la physique de la chromatine et la biologie se repondent, nous avons besoin d'outils pour analyser la dynamique de la chromatine in vivo. Plusieurs systèmes existent pour marquer les loci d'ADN et déterminer efficacement leur position dans le noyau, mais ils présentent des inconvénients dans les cellules de mammifères lorsqu'il s'agit d'étudier le mouvement de la chromatine dans le contexte de processus biologiques. Cela est particulièrement vrai lorsqu'il s'agit de mécanismes où l'ADN doit être lu à proximité du marquage. Pour étudier la dynamique de la chromatine in cellulo, l'équipe Bystricky a développé ANCHOR. ANCHOR repose sur l'insertion d'une séquence courte et non répétitive (ANCH) dans le génome de l'hôte. Cette séquence contient des sites de liaison pour une protéine (OR) qui, une fois liée, s'oligomérise et permet la visualisation du locus marqué. ANCHOR est dérivé des systèmes de partitionnement des chromosomes bactériens. L'outil a été implémenté avec succès dans la levure bourgeonnante (Saad et al. 2014) et plus récemment dans la drosophile (H. Chen, Fujioka, et Gregor 2017 ; Gomez-Lamarca et al. 2018). L'un de mes projets de thèse consistait à appliquer le système ANCHOR dans des cellules humaines. La séquence ANCH3 a été insérée de manière aléatoire et en une seule copie dans le génome de la lignée cellulaire de cancer du sein MCF7 par Hafida Sellou (étudiante en M2) et Fatima Moutahir (technicienne). Pour insérer la séquence ANCH3, les cellules MCF7 ont d'abord été modifiées pour insérer un site FRT dans le génome. Ensuite, un plasmide contenant l'ANCH3 couplé au transgène Cyclin D1 et un site FRT a été transfecté. La recombinaison entre les deux sites FRT a été favorisée par la Flipase. La protéine OR3 étiquetée par fluorescence a été exprimée de manière stable ou transitoire pour permettre l'imagerie du gène CCND1 (voir (Germier et al. 2017, 2018) pour plus de détails). Nous avons voulu établir une preuve de principe pour l'utilisation d'ANCHOR dans des cellules de mammifères. Des cellules MCF7 contenant un transgène CCND1, appelé G7-CCND1 (Germier et al. 2017) ont été transfectées de manière stable avec OR3-Santaka et le locus CCND1 a été suivi sur 24 heures à travers une division cellulaire. Nous avons pu suivre efficacement le locus du transgène sans photoblanchiment. La présence de la protéine OR3-Santaka sur le locus chromatinien n'a pas perturbé la réplication et deux loci ont été effectivement observés dans les deux cellules filles (Germier et al. 2018). En utilisant le système ANCHOR3, nous avons donc développé un outil puissant pour étudier à la fois des événements rapides et courts comme la transcription et des événements à long terme se déroulant sur plusieurs jours, comme la division ou la différenciation cellulaire.Chromatin dynamics are affected by biological processes. To understand how physical behaviour of chromatin and biology work together, we need tools to analyse chromatin motion in living cells. Several systems exist to fluorescently label DNA loci and to effectively determine their position within the nucleus, but they have drawbacks in mammalian cells when it comes to studying chromatin motion in the context of biological processes. This is especially true when it comes to mechanisms where DNA needs to be processed in the vicinity of the labeling. To study chromatin dynamics in cellulo, the Bystricky group developed the ANCHOR DNA labelling system. ANCHOR relies on the insertion of a short, non-repetitive sequence (ANCH) in the host genome. This sequence contains binding sites for a protein (OR) which once bound, oligomerize and allow visualization of the tagged locus. ANCHOR is derived from the bacterial chromosome partitioning systems. The tool was successfully implemented in budding yeast (Saad et al. 2014) and more recently in Drosophila (H. Chen, Fujioka, and Gregor 2017; Gomez-Lamarca et al. 2018). One of my thesis projects was to apply the ANCHOR system in human cells. The ANCH3 sequence was inserted randomly and in one copy in the genome of breast cancer cell line MCF7 by Hafida Sellou (M2 student) and Fatima Moutahir (technician). To insert the ANCH3 sequence, MCF7 cells were first modified to insert a FRT site in the genome. Then, a plasmid containing ANCH3 coupled to Cyclin D1 transgene and a FRT site was transfected. Recombination between the two FRT site was promoted by Flipase. The fluorescently-tagged OR3 protein was either stably or transiently expressed to allow imaging of the CCND1 gene (see (Germier et al. 2017, 2018) for details). We wanted to establish a proof of principle for the use of ANCHOR in mammalian cells. MCF7 cells containing a CCND1 transgene, called G7-CCND1 (Germier et al. 2017) were stably transfected with OR3-Santaka and the CCND1 locus was followed using fast- time lapse microscopy over 24 h through one cell division in a single cell. We could effectively follow the transgene locus without much photobleaching. The presence of OR3-Santaka protein on the chromatin locus did not disturb replication and two loci were effectively observed in the two daughter cells (Germier et al. 2018). Using the ANCHOR3 system, we hence developed a powerful tool to study both rapid, short events such as transcription and long-term events taking place over days, such as cell division or differentiation