Estudo de plantas aromáticas para potencial aplicação a embalagens alimentares activas

Dissertação de mestrado em Segurança Alimentar, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de CoimbraUma das principais causas da deterioração da qualidade dos alimentos é a peroxidação lipídica. A peroxidação lipídica dá origem à formação de espécies reactivas de oxigénio (ROS) e radicais livres. A oxidação tem consequências negativas a nível da qualidade nutricional e propriedades organolépticas dos alimentos, nomeadamente, diminuição do valor nutricional pela destruição de ácidos gordos essenciais e de vitaminas A, D, E e K (solúveis em lípidos), desenvolvimento de maus sabores e odores, mudanças de cor e a perda de aroma. Assim, o uso de antioxidantes em alimentos que contêm lipídos, minimiza a degradação oxidativa, retarda a formação de produtos oxidantes tóxicos e mantém a qualidade nutricional dos alimentos. Na indústria alimentar são bastante utilizados antioxidantes sintéticos, tais como, o BHA (butil-hidroxianisole), o BHT (butil-hidroxitolueno), o PG (galato de propilo) e o TBHQ (terc-butil-hidroquinona). No entanto, têm sido gradualmente substituídos por antioxidantes naturais, uma vez que o consumo de antioxidantes sintéticos tem sido associado a efeitos adversos para a saúde humana. Assim, as plantas aromáticas são vastamente estudadas por serem ricas em antioxidantes naturais, apresentando na sua constituição compostos fenólicos, que desempenham um papel fundamental para a saúde humana, actuando como possíveis agentes protectores, ajudando o corpo humano na redução dos danos oxidativos. Neste contexto, a indústria alimentar tem demonstrado um interesse crescente em compostos fenólicos, por prevenirem a degradação oxidativa dos lípidos, melhorando a qualidade e o valor nutricional dos alimentos e, deste modo, o aumento da vida útil dos produtos alimentares. Na primeira parte do presente estudo, analisaram-se dez espécies de plantas aromáticas (frescas e secas) recorrendo a quatro ensaios: sistema de inibição do radical DPPH, teste do branqueamento do β-caroteno e determinação do conteúdo em compostos fenólicos totais e flavonóides totais. As plantas aromáticas seleccionadas pertencem maioritariamente à família das Lamiáceas, nomeadamente, o alecrim, a hortelã, a hortelã-pimenta, o manjericão, a manjerona, o orégão, o tomilho e o tomilho-limão. As restantes espécies pertencem à família das Asteráceas, designadamente, o estragão e a stevia. Das espécies de plantas aromáticas seleccionadas, analisaram-se 15 espécies de agricultura convencional (7 amostras secas e 8 amostras frescas) e 6 de agricultura biológica (amostras secas) para posterior comparação com as plantas de agricultura convencional. iv ! No sistema de inibição do radical DPPH, o extracto metanólico de alecrim seco foi o que apresentou maior capacidade antioxidante (2,22 mg peso seco/mL) sendo que no teste do branqueamento do β-caroteno, o extracto metanólico de manjericão fresco foi o que apresentou maior capacidade antioxidante (AAC = 1083). Relativamente ao conteúdo em fenólicos totais, o extracto metanólico de orégão fresco foi o que apresentou maior quantidade destes compostos (26,27 mg GAE/g peso seco) e o conteúdo em flavonóides totais mais elevado foi apresentado pelo extracto metanólico de stevia fresca (53,75 mg ECE/g peso seco). Na segunda parte do presente estudo, foi desenvolvido e validado um método em Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência com Detector de Díodos (UHPLC-DAD), que permite quantificar simultaneamente dezanove compostos fenólicos, nomeadamente, ácido gálico, ácido protocatecuico, ácido clorogénico, ácido cafeico, epicatequina, ácido p-cumárico, ácido ferúlico, ácido 2-hidroxicinâmico, ácido rosmarínico, miricetina, resveratrol, ácido transhidroxicinâmico, quercetina, hesperetina, eugenol, carvacrol, timol, carnosol e ácido carnósico. A pré-coluna utilizada neste método foi uma UPLC® BEH C18 (2,1 x 5 mm, 1,7 μm de tamanho de partícula) e a coluna foi uma ACQUITY™ UHPLC® BEH C18 RP18 (2,1 x 50 mm, 1,7 μm de tamanho de partícula). As fases móveis do método foram: Solvente A - fase móvel (aquosa) constituída por água com ácido acético a 0,1 % (v/v); Solvente B - fase móvel (orgânica) constituída por acetonitrilo com ácido acético a 0,1 % (v/v), com eluição em gradiente. Para a validação do método avaliou-se os seguintes parâmetros: especificidade, gama de trabalho e linearidade, limite de detecção e de quantificação, precisão e exactidão. Quanto aos limites de detecção e quantificação, o método desenvolvido permite detectar e quantificar os compostos fenólicos em concentrações muito baixas (< 0,15 μg/mL, com excepção do carnosol e ácido carnósico). Considera-se ainda que o método foi validado em termos de precisão e exactidão (recuperação 82,8 - 103,9 %), tendo em consideração o fim pretendido da utilização do método desenvolvido em UHPLC-DAD. O método validado em UHPLC-DAD foi posteriormente aplicado a extractos metanólicos de 21 amostras de plantas aromáticas, para a determinação simultânea de 19 compostos fenólicos. Dos resultados obtidos, o extracto metanólico de tomilho seco foi o que apresentou maior diversidade em compostos fenólicos, apresentando 10 dos 19 compostos fenólicos estudados. O extracto desta planta apresentou elevadas quantidades de ácido rosmarínico e de timol. Para além do extracto de tomilho seco, outros extractos metanólicos de plantas apresentaram elevadas quantidades de carnosol e ácido carnósico (alecrim seco), timol (orégão seco), ácido rosmarínico (alecrim fresco), timol (tomilho fresco) ! v e ácido clorogénico (stevia fresca). Verificou-se ainda que o ácido rosmarínico está presente em todas as amostras analisadas, à excepção das amostras secas de orégão e estragão, ambas de agricultura biológica. Assim, é possível verificar que as plantas aromáticas estudadas são excelentes fontes de compostos antioxidantes fenólicos, revelando deste modo uma elevada capacidade antioxidante, destacando o alecrim seco, o manjericão fresco, o orégão fresco e a stevia fresca, além de outras que também apresentaram uma capacidade antioxidante relevante. Neste contexto, estas plantas podem ser incluídas na lista de plantas potenciais a ser utilizadas para preparar extractos que se possam incorporar a embalagens alimentares activaOne of the main causes for the deterioration of food quality is the lipid peroxidation. The lipid peroxidation leads to the formation of reactive oxygen species (ROS) and free radicals. The oxidation has negative consequences at nutritional and organoleptic properties of the food, namely, decreasing nutritional value by reducing the essential fatty acids and of vitamins A, D, E and K (lipid soluble), originating unpleasant tastes and odors, changes in color and the loss of aroma. Thus, the use of antioxidants in foods containing lipids minimizes the oxidative degradation, reduces the formation of toxic oxidants and maintains the nutritional quality of foods. ! In food industry, the synthetic antioxidants are widely used, such as BHA (butylated hydroxyanisole), BHT (butylated hydroxytoluene), PG (propyl gallate) and TBHQ (tertiary butylhydroquinone). Nevertheless, they have been gradually replaced by natural antioxidants considering that the consumption of synthetic antioxidants has been associated with adverse effects for human health. Therefore, the aromatic plants are extensively studied due to be good sources of natural antioxidants, exhibiting phenolics in its composition, which plays a fundamental role for human health, acting as possible protecting agents, helping the human body to reduce the oxidative damage. In this context, food industry has demonstrated a growing interest on phenolics, due to prevent lipid oxidative degradation, enhancing food quality and nutritional value and, so, increasing shelf life of food. In the first part of this study ten species of aromatic plants were analysed (dried and fresh) using four assays: inhibition system of the DPPH radical, the β-carotene bleaching (BCB) test, and determination of total phenolic compounds and total flavonoids contents. The selected aromatic plants mostly belong to the Lamiaceae family, namely: rosemary, spearmint, basil, oregano, thyme and lemon thyme. The remaining species of aromatic plants belong to the Asteraceae family, particularly tarragon and stevia. Of the species of aromatic plants selected, 15 species were analyzed from conventional agriculture (7 dried samples and 8 fresh samples) and 6 from organic farming (dried samples) for subsequent comparison with the plants in the conventional agriculture. ! In the inhibition system of the DPPH radical, the methanolic extract of dried rosemary presented the highest antioxidant capacity (2.22 mg dry weight/mL) while in β-carotene bleaching test, the methanolic extract of fresh basil showed the highest antioxidant capacity viii ! (AAC = 1083). Concerning the content of total phenolic compounds, the methanolic extract of fresh oregano exhibited the highest content of these compounds (26.27 mg GAE/g dry weight) and the highest content of total flavonoids was presented by the methanolic extract of fresh stevia (53.75 mg ECE/g dry weight). In the second part of this study, a method of Ultra High Performance Liquid Chromatography coupled with Diode Array detector (UHPLC-DAD) was developed and validated, which allows quantifying nineteen phenolic compounds simultaneously, including gallic acid, protocatechuic acid, chlorogenic acid, caffeic acid, epicatechin, p-coumaric acid, ferulic acid, 2-hydroxycinnamic acid, rosmarinic acid, myricetin, resveratrol, transhydroxycinnamic acid, quercetin, hesperetin, eugenol, carvacrol, thymol, carnosol and carnosic acid. The precolumn used in this method was a UPLC® BEH C18 (2.1 x 5 mm, 1.7 μm particle size) and the column was an ACQUITY™ UHPLC® BEH C18 RP18 (2.1 x 50 mm, 1.7 μm particle size). The mobile phases of the method were: Solvent A - water with acetic acid at 0.1% (v/v); Solvent B - acetonitrile with acetic acid at 0.1% (v/v), with gradient elution. For the validation of the method the following parameters were evaluated: specificity, working range and linearity, limit of detection and quantification, precision and accuracy. Regarding the limits of detection and quantification, the developed method allows to detect and quantify the phenolic compounds at very low concentrations (< 0.15 μg/mL, with exception of carnosol and carnosic acid). It is further considered that the method was validated in terms of precision and accuracy (recovery 82.8 - 103.9 %), whereby the values are valid, considering the intended purpose of the developed UHPLC-DAD method. ! The validated UHPLC-DAD method was applied to methanolic extracts of 21 aromatic plant samples to determine 19 phenolic compounds simultaneously. Frem the obtained results, the methanolic extract of dried thyme presented highest diversity of phenolic compounds, showing 10 out of 19 studied phenolic compounds. This plant extract showed high amounts of rosmarinic acid and thymol. Besides the dry thyme, other aromatic plants methanolic extracts presented high amounts of carnosol and carnosic acid (dry rosemary), thymol (dry oregano), rosmarinic acid (fresh rosemary), thymol (fresh thyme) and chlorogenic acid (fresh stevia). There was still the presence of rosmarinic acid in all samples, with exception of dried oregano and tarragon, both from organic farming. Therefore, is possible to verify that the aromatic plants studied are excellent sources of antioxidant phenolic compounds, thereby revealing a high antioxidant capacity, besides others which also showed a relevant antioxidant capacity, it is possible to highlight dry rosemary, fresh basil, fresh oregano and fresh stevia. In this context, these plants can be ! ix included in the list with potential plants to be used to prepare extracts that may incorporate active food packagin